麗江瑪咖和秘魯瑪咖功效和安全性對比研究

吳德松，張夢麒，趙道強，柴琇瑛，顏 宏，彭玲芳，崔 濤

（1. 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2. 云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明 650111）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）為十字花科獨行菜屬一年或兩年生草本植物，原產于秘魯海拔3 500米以上的安第斯山區[1]。瑪咖傳統上作為食物和草藥用于增強精力、抗疲勞、改善性功能、提高生育力和治療女性更年期綜合征等[2]。化學成分研究結果顯示：瑪咖的特征性活性成分為瑪咖酰胺和瑪咖烯，除此之外還含有豐富的蛋白質、氨基酸、微量元素、礦物質等多種營養物質，以及多糖、生物堿、揮發油等成分，它們共同構成了瑪咖保健和藥用活性的物質基礎[3]?，F代藥理學研究表明，瑪咖具有提高性能力及精子數量，抗應激，調節內分泌、增強免疫、抗腫瘤、預防前列腺肥大、抗骨質疏松及增強營養等活性[4]，具有較高的研究和開發價值。

瑪咖適合生長在晝夜溫差大、陽光充足、缺氧、缺肥料、海拔3 500米左右的高海拔地區，云南麗江地區因海拔和地理環境與秘魯相似，瑪咖的引種種植已獲得成功，并形成大規模種植基地[5]。但是，由于云南麗江和秘魯的土壤礦物質、微生物環境、日照強度、晝夜溫差和大氣狀態等自然條件存在一定的差異，所栽培出的瑪咖在成分上可能會有所不同。孫曉東等[6]的研究顯示：麗江瑪咖和秘魯瑪咖在營養組成和含量上基本相似，但麗江瑪咖片在脂肪、鐵元素含量上明顯低于秘魯瑪咖，而在精氨酸含量和不飽和脂肪酸相對含量上高于秘魯瑪咖片。張愷驊[7]的研究表明：秘魯瑪咖的蛋白質、氨基酸含量低于國內引種瑪咖，瑪咖酰胺含量低于云南產瑪咖。物質基礎的改變可能會導致瑪咖的有效性和安全性發生變化，為了闡明麗江瑪咖與秘魯瑪咖在藥效學和安全性上的差異，本研究根據瑪咖的傳統功效，從緩解體力疲勞和改善性功能方面對麗江瑪咖和秘魯瑪咖進行活性對比研究，并初步評價其安全性，為其進一步開發利用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麗江瑪咖和秘魯瑪咖干粉（批號 150520）：云南省藥物研究所天然藥物化學研究室。制備方法：取瑪咖塊根，切片、干燥、粉碎后過200目篩，常溫密封干燥保存。

肝/肌糖原測定試劑盒（比色法）（批號20190121），尿素氮（BUN）測試盒（二乙酰肟比色法）（批號20190114）：南京建成生物工程研究所；丙酸睪酮注射液（批號1202061）：天津金耀氨基酸有限公司；苯甲酸雌二醇注射液（批號070512），2 mg/mL：自制；黃體酮注射液（批號101010）：浙江仙琚制藥股份有限公司。

SPF級KM小鼠，體重18～22 g：遼寧長生生物技術有限公司（實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001）；本研究試驗動物使用許可證：SYXK（滇）K2017-0004（發證單位昆明市科技局）。

1.2 儀器與設備

SQP型電子分析天平：賽多利斯（北京）科學儀器有限公司生產；JJ-2000型電子天平：江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；W-201型恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司生產；X201型光學顯微鏡：南京江南光電集團股份有限公司生產；Multiskan GO型全波長酶標儀：Thermo公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 麗江瑪咖和秘魯瑪咖緩解體力疲勞功能對比研究

1.3.1.1 對小鼠負重游泳時間的影響 參照文獻方法[8]，取SPF級KM小鼠48只，隨機分為空白組、秘魯瑪咖4.0 g/kg、麗江瑪咖2.0 g/kg和4.0 g/kg劑量組，每組 12只。麗江瑪咖和秘魯瑪咖均以20 mL/kg給藥體積灌胃給藥，空白組給予等體積純水，1次/d，連續 30 d。末次給予受試樣品后30 min，將尾根部負荷5%體重鉛條的小鼠置于游泳箱中游泳（水溫(25±1) ℃，水深不低于30 cm）。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間（min），即小鼠負重游泳時間，并對結果進行統計學分析。

1.3.1.2 對小鼠肝糖原水平的影響 參照文獻方法[8]，取SPF級KM小鼠48只，動物分組、給藥途徑、給藥劑量和給藥頻次均同前所述。末次給予受試樣品30 min處死小鼠，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟（75.0±1.0） mg，參照肝/肌糖原檢測試劑盒說明書測定肝糖原的含量，并對結果進行統計學分析。

1.3.1.3 對小鼠血清尿素氮水平的影響 參照文獻方法[8]，取SPF級KM小鼠48只，動物分組、給藥途徑、給藥劑量和給藥頻次均同前所述。末次給予受試樣品30 min后，小鼠置于30 ℃水中不負重游泳90 min。休息60 min后摘除眼球取血。全血置于4 ℃冰箱中3 h，待血液凝固后2 000 r/min離心15 min分離血清，參照尿素氮（BUN）檢測試劑盒說明書，測定小鼠血清尿素氮水平，并對結果進行統計學分析。

1.3.2 麗江瑪咖和秘魯瑪咖改善性功能作用對比研究

1.3.2.1 對小鼠交配能力的影響 取性成熟的KM 雄鼠 60只，隨機分為空白組、丙酸睪丸酮0.01 g/kg、秘魯瑪咖4.0 g/kg、麗江瑪咖2.0 g/kg和4.0 g/kg劑量組，每組12只。其中丙酸睪丸酮組以0.4 mL/kg給藥體積肌肉注射給藥，1次/2 d；麗江瑪咖和秘魯瑪咖均以 20 mL/kg給藥體積灌胃給藥，空白組給予等體積純水，1次/d，連續30 d。給藥期間每10 d觀察動物交配能力1次，于觀察前 48 h雌鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.04 mg/只，觀察前4 h雌鼠皮下注射黃體酮注射液0.2 mg/只，使雌鼠動情期相同[9-10]。觀察于晚上7～11時進行，將雄鼠單獨放入籠中適應5 min后每籠放入1只雌鼠，計時觀察雄鼠捕捉潛伏期（自雌鼠投入至雄鼠第1次捕捉雌鼠的時間）、20 min內雄鼠捕捉雌鼠的次數、交配潛伏期（自雌鼠投入至雄鼠第1次與雌鼠交配的時間）、20 min內交配次數，并對結果進行統計學分析。

1.3.2.2 對小鼠精子數量、精子活率的影響 參考文獻[11-12]方法，將盛有4 mL生理鹽水的小燒杯置于恒溫水浴箱內預熱至 37 ℃。取給藥結束后小鼠頸椎脫臼處死，快速剖取小鼠雙側附睪，剔除周圍脂肪組織，將附睪放入預熱的燒杯中減碎，搖勻，37 ℃孵育 15 min，使精子充分游離。取10 μL精子混懸液，用生理鹽水 200倍稀釋后滴入血細胞計數板上，顯微鏡下計數1個大方格內精子數（n），每毫升精子數為n×稀釋倍數×104，并對結果進行統計學分析。另取1份精子涂片，顯微鏡下計數有活動力及無活動力的精子數（至少計數200個精子），按下列公式計算精子活率（%）。

1.3.2.3 對小鼠性腺器官指數的影響 參考文獻[13]方法，剖取上述小鼠睪丸、包皮腺和精囊稱重，按下列公式計算性腺器官指數，并對結果進行統計學分析。

1.3.3 小鼠急性毒性試驗

由于瑪咖為南美洲傳統食物，安全性較高，因此我們將采用最大給藥量法進行試驗。首先進行最大給藥濃度摸索，分別稱取麗江瑪咖和秘魯瑪咖樣品，加適量純水充分研磨均勻，配制成剛好能通過小鼠灌胃針的混懸液最大濃度為0.437 g/mL；為了充分暴露樣品的毒性，灌胃體積設定為40 mL/kg，由此折算小鼠的給藥劑量為17.48 g/kg。

參考文獻[14-15]方法，取KM小鼠60只，隨機分為空白組、麗江瑪咖17.48 g/kg劑量組和秘魯瑪咖17.48 g/kg劑量組，每組20只，雌雄各半。禁食不禁水6 h后，各組均以40 mL/kg灌胃給予相應樣品。給藥當天連續4 h觀察并記錄動物出現的各種毒性反應、癥狀和死亡情況；以后每天觀察1次，連續觀察14 d。主要觀察動物飲食、外觀、行為活動、分泌物、排泄物等是否異常、死亡情況、中毒反應癥狀及其起始時間、嚴重程度、持續時間、是否可逆及恢復時間等。分別于給藥前、給藥后第3、7和14 d對存活動物稱重，觀察動物體重變化情況，并對體重結果進行統計學分析。觀察期14 d結束后處死動物，大體解剖觀察各組動物臟器、器官的體積、顏色、質地等有無明顯異常。

1.4 數據分析

采用 SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理，以±SD表示，數據經正態性檢驗和方差齊性檢驗滿足正態分布和方差齊同后作單因素方差分析，組間差異用LSD法比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 麗江瑪咖和秘魯瑪咖緩解體力疲勞作用對比研究

麗江瑪咖和秘魯瑪咖對小鼠游泳時間、肝糖原和血清尿素氮水平的影響結果見表1。結果顯示：與空白組比較，麗江瑪咖和秘魯瑪咖均可明顯提升小鼠負重游泳時間（P＜0.05或P＜0.01），提升肝組織糖原水平（P＜0.05），降低小鼠血清尿素氮水平（P＜0.05或P＜0.01）；與秘魯瑪咖比較，麗江瑪咖的活性無明顯差異（P＞0.05）。

表1 麗江瑪咖和秘魯瑪咖緩解體力疲勞對比表（±SD，n=12）Table 1 Effects of Lijiang maca and Peru maca on swimming time, liver glycogen and Serum urea nitrogen in mice (±SD, n=12)

表1 麗江瑪咖和秘魯瑪咖緩解體力疲勞對比表（±SD，n=12）Table 1 Effects of Lijiang maca and Peru maca on swimming time, liver glycogen and Serum urea nitrogen in mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 負重游泳時間/min 肝糖原/（mg/g肝組織） 尿素氮/（pmol/L）空白組 - 27.05±19.04 11.58±5.03 756.59±82.12秘魯瑪咖 4.0 46.96±15.98* 16.55±6.25* 659.56±59.93**2.0 35.97±14.59 17.92±7.60* 700.74±45.15麗江瑪咖 4.0 45.12±7.50** 17.64±7.06* 676.32±79.96*

2.2 麗江瑪咖和秘魯瑪咖改善性功能作用對比研究

麗江瑪咖和秘魯瑪咖對小鼠捕捉潛伏期、捕捉次數、交配潛伏期和交配次數的對比研究見表2～4。結果顯示：與空白組比較，在各檢測時間點秘魯瑪咖4.0 g/kg劑量對小鼠交配能力均具有明顯的提升作用（P＜0.05），麗江瑪咖4.0 g/kg劑量連續給藥 20和 30 d可明顯提升小鼠交配能力（P＜0.05或P＜0.01）。與秘魯瑪咖組比較，麗江瑪咖組小鼠捕捉潛伏期、捕捉次數、交配潛伏期和交配次數均無明顯改變（P＞0.05）。

表2 受試樣品給藥10 d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 2 Effect of samples administration for 10 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

表2 受試樣品給藥10 d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 2 Effect of samples administration for 10 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05，**P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 捕捉潛伏期/s 捕捉數/次 交配潛伏期/s 交配數/次空白組 - 381.67±162.64 6.92±3.70 895.08±358.90 2.08±1.78丙酸睪酮組 0.01 216.67±150.72* 10.42±4.08* 658.07±253.73 7.25±6.27*秘魯瑪咖 4.0 247.17±93.88* 11.75±4.79* 801.33±412.72 3.83±2.86 2.0 317.75±183.97 8.68±3.37 868.92±310.34 2.92±3.12麗江瑪咖 4.0 325.25±143.44 9.25±5.63 850.25±360.26 4.00±3.05

表3 受試樣品給藥20d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 3 Effect of samples administration for 20 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

表3 受試樣品給藥20d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 3 Effect of samples administration for 20 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05，**P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 捕捉潛伏期/s/ 捕捉數/次空白組 - 283.33±141.67 6.33±4.44丙酸睪酮組 0.01 154.17±137.28* 7.67±2.27秘魯瑪咖 4.0 173.17±53.60* 6.25±3.39 2.0 198.25±81.44 6.58±2.15麗江瑪咖 4.0 207.58±94.50 7.08±4.10交配潛伏期/s 交配數/次745.08±382.48 6.42±3.94 271.08±192.79** 13.92±7.97**444.75±275.24* 11.17±5.39*547.50±287.43 8.08±3.20 454.92±254.82* 10.67±5.47*

表4 受試樣品給藥30 d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 4 Effect of samples administration for 30 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

表4 受試樣品給藥30 d對小鼠交配能力的影響（±SD，n=12）Table 4 Effect of samples administration for 30 days on the mating ability of mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 捕捉潛伏期/s 捕捉數/次 交配潛伏期/s 交配數/次空白組 - 292.50±162.43 5.25±3.65 458.42±276.10 12.25±5.59丙酸睪酮組 0.01 114.17±90.30** 5.42±2.64 163.50±76.69** 18.92±6.10*秘魯瑪咖 4.0 164.83±47.68* 5.17±2.48 239.50±92.95* 18.92±6.42*2.0 187.42±83.78 6.08±2.23 289.17±195.55 16.25±6.66麗江瑪咖 4.0 143.92±63.31** 5.25±2.60 187.50±81.39** 21.33±7.58**

麗江瑪咖和秘魯瑪咖對小鼠精子數量和活率的影響見表5。結果顯示：與空白組比較，秘魯瑪咖4.0 g/kg和麗江瑪咖4.0 g/kg劑量可顯著提升小鼠精子數量（P＜0.05），丙酸睪酮組小鼠精子數量明顯下降（P＜0.05）；秘魯瑪咖和麗江瑪咖各劑量對小鼠精子活率均無明顯影響（P＞0.05）。與秘魯瑪咖組比較，麗江瑪咖組小鼠精子數量和活率均無明顯改變（P＞0.05）。

表5 受試樣品對小鼠精子數量和活率的影響（±SD，n=12）Table 5 Effect of samples on the sperm count and viability of mice (±SD, n=12)

表5 受試樣品對小鼠精子數量和活率的影響（±SD，n=12）Table 5 Effect of samples on the sperm count and viability of mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 精子數量/（×106個/mL） 精子活率/%空白組 - 4.90±1.25 53.08±9.12丙酸睪酮組 0.01 3.96±0.86* 57.50±14.06秘魯瑪咖 4.0 5.91±1.05* 56.58±11.60 2.0 4.94±1.48 54.50±11.10麗江瑪咖 4.0 6.02±1.18* 55.92±12.03

麗江瑪咖和秘魯瑪咖對小鼠性腺器官指數的影響見表6。結果顯示：與空白組比較，秘魯瑪咖和麗江瑪咖4.0 g/kg劑量組小鼠睪丸指數明顯增加（P＜0.05），丙酸睪酮 0.01 g/kg劑量組動物睪丸指數明顯降低（P＜0.01）。與空白組比較，各組對其他小鼠性腺器官指數均無明顯影響（P＞0.05）。

表6 受試樣品對小鼠性腺器官指數的影響（±SD，n=12）Table 6 Effect of samples on the gonadal organ index of mice (±SD, n=12)

表6 受試樣品對小鼠性腺器官指數的影響（±SD，n=12）Table 6 Effect of samples on the gonadal organ index of mice (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與秘魯瑪咖組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01; compared with the Peru maca group, ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01.

組別 劑量/（g/kg） 睪丸指數/（mg/g） 精囊指數/（mg/g） 包皮腺指數/（mg/g）空白組 - 5.75±0.87 9.20±1.80 2.33±0.65丙酸睪酮組 0.01 4.63±0.98** 10.10±1.83 2.72±0.78秘魯瑪咖 4.0 6.92±1.38* 9.51±1.47 2.21±0.86 2.0 6.33±1.23 9.44±0.78 2.16±0.67麗江瑪咖 4.0 6.75±1.22* 9.72±1.28 2.34±1.44

2.3 麗江瑪咖和秘魯瑪咖小鼠急性毒性試驗

小鼠急性毒性試驗結果顯示：空白組所有動物給予純水后一般狀況良好，未見明顯異常反應和死亡。麗江瑪咖和秘魯瑪咖的小鼠單次灌胃給藥的最大給藥量為17.48 g/kg，給藥后4 h內和觀察期14 d內小鼠未見明顯毒性反應和死亡情況。在觀察期14 d內，與空白組比較，麗江瑪咖和秘魯瑪咖17.48 g/kg劑量組動物體重均無明顯變化（P＞0.05），觀察期動物體重變化情況見表7。觀察期結束后頸椎脫臼處死小鼠，肉眼觀察各組動物臟器的體積、顏色、質地等，均未見明顯異常。

表7 觀察期14 d內各組動物體重（±SD，n=20）Table 7 Animal body weight of each group within 14 days of observation period (±SD, n=12)

表7 觀察期14 d內各組動物體重（±SD，n=20）Table 7 Animal body weight of each group within 14 days of observation period (±SD, n=12)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別 劑量（g/kg） 性別 給藥前 給藥后3 d 給藥后7 d 給藥后14 d空白組 - ♂ 20.76±1.01 26.20±1.53 30.89±1.83 37.99±2.34♀ 20.39±1.11 25.86±1.72 28.56±2.22 35.89±2.69麗江瑪咖 17.48 ♂ 20.59±0.97 26.05±1.13 30.00±3.97 38.11±4.33♀ 20.44±1.25 25.08±1.48 28.57±2.40 36.01±2.22秘魯瑪咖 17.48 ♂ 20.37±1.00 26.49±1.22 29.98±3.12 38.14±3.69♀ 20.83±1.09 25.12±1.29 28.75±1.75 35.31±1.83

3 討論

目前，許多藥理學研究已經證實，瑪咖具備較好的緩解體力疲勞作用，其中瑪咖酰胺和瑪咖烯的含量與緩解體力疲勞評價的金指標負重游泳時間呈正相關性，是潛在的藥效物質[16-18]。張愷驊[7]對比了幾種瑪咖中瑪咖酰胺的種類和含量，發現云南產瑪咖中瑪咖酰胺的種類有8種，秘魯瑪咖僅檢出3種瑪咖酰胺；云南產瑪咖中瑪咖酰胺的相對含量高于秘魯瑪咖，相對含量分別為39.73和26.46。在研究開展之前，我們曾根據物質基礎推測麗江瑪咖的緩解體力疲勞活性可能優于秘魯瑪咖。但是，經試驗研究證實，麗江瑪咖和秘魯瑪咖均可明顯提升小鼠負重游泳時間和肝組織糖原水平，并可顯著下調小鼠血清尿素氮含量，此結果提示二者均具備緩解體力疲勞功能，且從數據統計學分析結果來看二者的活性無顯著性差異。

小鼠交配試驗是常用的性功能鑒定試驗，性行為是一種復雜的行為活動，包括動機和行為兩個方面。雄鼠的性行為包括捕捉、乘騎、插入和射精四種，可以通過每一種的潛伏期長短及次數多少來評價雄性小鼠的性欲及性能力[19]。在本研究中秘魯瑪咖和麗江瑪咖對小鼠捕捉潛伏期、交配潛伏期、交配次數均具有顯著的提升，且效果與陽性對照藥物丙酸睪酮注射液相比無顯著性差異，這表明秘魯瑪咖和麗江瑪咖均可提升小鼠性功能；但是，從起效時間來看，秘魯瑪咖在給藥10 d后的第1次檢測即顯示出明顯活性，而麗江瑪咖則需要更長的起效時間。

臟器指數，即某臟器的濕重與體重的比值，能在一定程度上反映實驗動物機體的健康狀況。睪丸是雄性動物生殖器官，其主要作用是產生精子和雄性激素，對機體的生長發育和生殖器官功能的維持起重要作用。本研究結果顯示，秘魯瑪咖和麗江瑪咖均可明顯提高小鼠睪丸指數，與之相對應的精子數量亦有顯著增加，經對比發現二者在此方面的活性無明顯差異。在試驗過程中，我們觀察到陽性對照組小鼠長期注射丙酸睪酮注射液后，精子數量和睪丸指數均出現明顯下降，這可能跟丙酸睪酮注射液長期應用所產生的睪丸萎縮和精子減少等不良反應有關[20]。

從安全性結果來看，麗江瑪咖和秘魯瑪咖的最大給藥量均為17.48 g/kg，觀察期內小鼠未見明顯毒性反應和死亡情況，觀察期14 d結束后各組織和器官亦未發生肉眼可見病理改變。上述結果初步表明，麗江瑪咖和秘魯瑪咖安全性較高，且二者無明顯差異。根據衛生部此前發布的《關于批準瑪咖粉作為新資源食品的公告》，瑪咖的成人推薦用量為≤25 g/d，即成人每日用藥劑量約為0.42 g/kg（成人體重以60 kg計），約為本研究中小鼠最大給藥量的1/42。據此也可推測麗江瑪咖和秘魯瑪咖在推薦用量下具備較高的食用安全性。但是，由于僅進行了急性毒性研究，其長期應用的毒性、遺傳毒性、生殖毒性有待于進一步深入研究。

綜上所述，麗江瑪咖和秘魯瑪咖均具備緩解體力疲勞、改善性功能的作用，且在本研究所涉及的藥效學活性和安全性方面無明顯差異。