肺泡巨噬細胞極化及凋亡在膿毒癥急性肺損傷中作用機制的研究進展

高煜茹 王濤

膿毒癥是一種由于細菌感染引發的全身炎癥反應綜合征，是入侵的病原體造成宿主機體反應失調從而導致多個器官功能障礙進而危及生命。急性肺損傷（ALI）是膿毒癥中常見且致死率較高的并發癥之一。ALI 的發病機制復雜，目前尚未完全闡明，但當前的研究表明炎癥是ALI 的一個重要機制。肺泡巨噬細胞（AM）是肺內主要的先天免疫效應細胞，可根據環境信號改變自身的功能和表型。AM的高度可塑性在啟動和化解肺部炎癥中起著關鍵作用。當病原體入侵肺泡后，AM 會分泌高水平的促炎介質，巨噬細胞極化及凋亡失衡進而導致炎癥級聯調節失調是膿毒癥急性肺損傷的主要病理生理機制，被認為是治療膿毒癥急性肺損傷的重要靶點。本文就AM 的概念、作用以及膿毒癥急性肺損傷中的肺泡巨噬細胞極化及凋亡進行簡要闡述。

1 肺泡巨噬細胞的概念

中性粒細胞和巨噬細胞的激活同為ALI 免疫及炎癥反應的病理標志[1，2]，AM 是肺巨噬細胞（LMS）的一個亞群，來源于由卵黃囊中產生的晚期紅系髓系祖細胞（EMPS）發育而來的胎肝單核細胞，在胚胎發育期間定植于肺，并在圍產期形成完全成熟的AM。AM 是細支氣管肺泡腔中含量豐富的細胞類型，約占肺泡白細胞的95%[3]，是肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT2s）產生的表面活性物質分解代謝的重要細胞。作為肺抵御外來刺激的重要效應細胞，在ALI 參與的肺部炎癥的發病機制中起關鍵作用[4]。

2 肺泡巨噬細胞的表型和功能

AM 的活化促進ALI 中涉及的肺部炎癥。巨噬細胞根據其特點及功能，大致被分為兩個亞群，即經典激活的巨噬細胞M1 和交替激活的巨噬細胞M2。M1 巨噬細胞主要參與炎癥及免疫反應，其在外部刺激的作用下，通過特異性受體及多個信號通路，可極化分泌包括白細胞介素及趨化因子在內的多種細胞炎性因子，其釋放的一氧化氮（NO）傾向于抑制細胞增殖及誘導細胞損傷，且具有較高的抗原提呈活性及促炎表型，可消除細菌、真菌、病毒能引起感染的能力。M2 巨噬細胞包括三個亞群，分別為M2a、M2b、M2c，這三個亞群對不同的刺激產生反應，M2a 巨噬細胞由IL-4 和IL-13 誘導，M2b 巨噬細胞由免疫復合物聯合LPS 或IL-1b 誘導，M2c巨噬細胞由抗炎刺激（包括糖皮質激素、IL-10 或TGF-b）誘導。但均表達較高水平的CD11 及抗炎因子（包括IL-10、CCL24、CCL22），抑制炎癥反應及促炎免疫反應的進行，從而抑制組織及細胞的炎性反應，進而利于組織修復和血管形成[5]。有研究發現，暴露于LPS 后的巨噬細胞總數會明顯增加，且以炎性M1 巨噬細胞增加為主，M1 表達產物也相應增加，與此同時抗炎M2 巨噬細胞會減少，其產物也相應減少[6]。

巨噬細胞在多種疾病及炎癥反應中發揮重要作用，因此巨噬細胞的激活已成為免疫學、組織動態平衡、疾病發病機制以及消解和非消解炎癥的關鍵領域[7]。巨噬細胞極化過程復雜，近幾年的研究發現，巨噬細胞可表達一系列模式識別受體，包括Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）、炎癥體和凝集素樣受體，它們戰略性地位于細胞膜、細胞質和內膜室[8]，進而介導巨噬細胞的極化，極化過程涉及多種分子機制，主要包括TLR4/NF-κB、JAK/STAT、TGF-β/Smads、PPARg、Notch 和miRNA 等信號傳導途徑及炎癥影響因子[9]，通過調節各種炎癥介質的合成和釋放，AM 嚴重影響感染和非感染性刺激后ALI 的發展。

3 影響肺泡巨噬細胞極化的信號通路

3.1 TLR4-MAPK 信號通路LPS 可與Toll 樣受體4（TLR4）相互作用，并與細胞內連接蛋白MyD88 接觸。這種LPS-TLR4-MyD88 信號復合物進一步觸發兩種重要的信號級聯，即NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑[10]，從而刺激巨噬細胞激活，進而MAPK 及其底物MK2 被p38 直接磷酸化和激活，MK2 激活后通過調節細胞因子如TNF-α、IL-6 來介導炎癥反應。有研究證實，MK2 可調節由LPS 誘導的ALI 中炎癥因子的產生進而影響巨噬細胞的活化，RNA 結合蛋白Lin28 可以實現在Akt1調控下調節TLR4 影響巨噬細胞的活化[11]。

3.2 TLR4-NF-κB 信號通路TLR4 是一種表達于巨噬細胞表面的天然免疫受體，能有效識別病原體相關的分子模式，是LPS 的主要受體。LPS 與TLR4結合，通過髓系分化因子88（MyD88）依賴的途徑或干擾素調節因子（IRF）3 激活核因子-κB（NF-κB），從而促進炎癥因子的表達[12]。最近，許多藥物被證明通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路來抑制M1 巨噬細胞極化。例如，小檗堿可以競爭性地抑制TLR4和MyD88 的結合，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路，從而抑制M1 巨噬細胞極化。同樣，槲皮素下調NF-κB 和IRF5 的表達，進而抑制上游TLR4/MyD88 的活性，從而抑制M1 極化。此外，化合物NZ、甲異靛藍等可抑制M1 巨噬細胞極化，這與下調TLR4/NF-κB 信號通路有關。阻斷NRF2 可明顯減弱DHA 對巨噬細胞中NF-κB/p65 轉位的抑制作用，提示DHA 以NRF2 依賴的方式抑制巨噬細胞中的NF-κB 途徑[12]。這些發現充分說明了TLR4/NF-κB 信號通路在M1 巨噬細胞極化中的重要作用。

3.3 TLR4-Akt/FoxO1 信號通路LPS 通過與TLR4受體結合，進一步誘導PI3K 蛋白的磷酸化，從而激活Akt 蛋白表達。FoxO1 是Akt 的一個關鍵下游蛋白，介導免疫調節，轉化生長因子-β 增加了LPS刺激的巨噬細胞Akt 的磷酸化水平[13]。一旦Akt被激活，它就會誘導Akt 下游的靶蛋白p-FoxO1，p-FoxO1 被去磷酸化形成FoxO1 并轉移到細胞核。FoxO1 可上調IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、CD44、活性Caspase-8、CD163、MDA5、IREα、BAX 和Caspase-3 的表達，下調IL-10、SOD-1 和Bcl-2 的表達，從而調節炎癥、氧化應激和細胞凋亡[14]。

3.4 JAK/STAT 信號通路Janus 激酶（JAK）信號轉導和轉錄激活因子（STAT）通路主要介導細胞因子受體的信號傳導。IFN-γ 與其受體結合并激活JAK，誘導STAT1 的磷酸化，從而導致巨噬細胞對M1 的極化。此外，IFN-γ 可增強巨噬細胞對炎癥介質的敏感性，并通過阻斷對TLR 信號的反饋抑制而發揮協同作用，同時NF-κB 和MAPK 也可增強JAK/STAT1 的轉錄活性。此外，STAT3 在M2 巨噬細胞極化中也起了重要作用。研究表明，IL-6/STAT3 和JAK3/STAT3 信號通路的抑制導致巨噬細胞從M2 表型向M1 表型極化。細胞因子信號抑制因子（SOCS）是JAK/STAT 信號的反饋抑制因子。當SOCS1 和SOCS3 缺失時，可通過激活JAK1/STAT1 信號通路來促進M1 巨噬細胞極化。而STAT3 磷酸化的增加可以通過上調SOCS3 的表達而反饋抑制STAT1 的表達，從而抑制JAK/STAT1信號通路介導的巨噬細胞極化[12]。此外，STAT3 是Treg 細胞分化的決定因素，調節性T 細胞（Treg 細胞）是一種抑制性T 細胞亞群，通過多種機制發揮免疫抑制作用，并創造合適的免疫環境來控制免疫應答，Treg 細胞在ALI 的進展中起著至關重要的作用，Tregs 可通過調節免疫反應、促進肺泡上皮細胞增殖和組織修復來促進ALI 的恢復[15]，由M2 極化的細胞因子誘導的STAT6 調節簇及由干擾素激活的STAT1 信號可促進走向更抗炎和調節極化狀態，但具體機制尚不明確[16]。

3.5 NLRP3/Caspase-1 信號通路NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥體是由NLRP3、凋亡斑點蛋白（Asc）和前Caspase-1 組成的細胞內多蛋白復合體。Caspase-1 p10 是NLRP3 炎癥體激活的生物標志物，當受到刺激時，NLRP3 炎癥體的激活導致半胱氨酸天冬氨酸氨基轉移酶-1（Caspase-1）的激活，隨后通過復雜的途徑將前白介素1β（IL-1β）和前IL-18 轉化為成熟的生物活性形式，從而導致巨噬細胞對M1 的極化[17，18]，此外，有研究證明，NF-κB在NLRP3 炎癥體的啟動中發揮了重要作用[19]。

3.6 TGF-β/Smads 信號通路TGF-β 首先對Ⅱ型受體起作用，然后與Ⅰ型受體結合形成受體復合物，導致Ⅰ型受體結構域磷酸化，從而通過激活其下游信號分子（Smad2 和Smad3）調節相關基因的表達。有研究發現，來自TGF-β 超家族的生長分化因子3 通過促進Smad2 和Smad3 的磷酸化來抑制M1并促進M2 極化[14]。

3.7 MEK1/2-ERK1/2 通路MAPK 是一種應激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其參與細胞因子產生、細胞遷移、細胞周期控制、DNA 損傷反應和轉錄調控。MEK1 和MEK2 參與細胞內信號網絡，通過MEK1/2 依賴的絲氨酸和酪氨酸磷酸化對下游效應分子ERK1 和ERK2 進行控制[20]。MEK1/2-ERK1/2 通路可以被細胞外刺激，如生長因子和細胞因子，以及Ras 和Raf（13）下游的信號所激活，所以MEK1/2-ERK1/2 被認為可能是調節巨噬細胞反應的潛在機制之一[21]。通過對正常人和ARDS患者肺泡巨噬細胞的比較，發現ARDS 患者肺泡巨噬細胞MEK1/2-ERK1/2 通路的激活水平升高，提示巨噬細胞MEK1/2-ERK1/2 通路的異常信號可能與人ALI 的發病機制有關，可作為臨床干預的治療靶點。CSF1R 激活的下游分子MEK1/2、ERK1/2 和c-jun，可促使ERK1/2 及其下游轉錄因子c-jun 的磷酸化，CSF1-CSF1R-MEK1/2-ERK1/2-c-jun 軸可調節巨噬細胞向M1 或M2 極化狀態[22]。

4 影響肺泡巨噬細胞極化的細胞因子

4.1 miRNAmiRNAs 是一類長度為22 個核苷酸的非編碼RNAs，由各種類型的細胞通過外切體或蛋白質介導的途徑分泌[10，11]。此外，生物學分析和功能研究表明，胞外miRNAs 具有高度的穩定性，不僅可以作為各種疾病的生物標志物，還可以作為新的信號分子參與巨噬細胞極化。芳香烴受體（AhR）是調節炎癥和巨噬細胞極化的重要成分，其可以結合miR-142a 啟動子轉錄激活miR-142a，通過AhR-miR-142a-IRF1/HIF-1α 軸降低M1 巨噬細胞極化、驅動M2 巨噬細胞抑制全身炎癥和損傷[23]。miR-155 是脂多糖/干擾素-γ 處理的巨噬細胞中表達最高的miRNA，miR-155 通過外切體進入巨噬細胞促進炎癥基因的表達（如IL-1β、IL-6和iNOS），也可通過CCAAT/增強子結合蛋白（C/eBP-β）信號級聯促進巨噬細胞M1 極化。miR-146 具有強大的抗炎作用，它通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF）-6、IL-1 受體相關激酶（IRAK1）、STAT-1 和TLR4 而促進M2 表型[24]。當miR-124 過表達，通過抑制PELI1/IRF5 軸并顯著抑制IRF5 的核轉位，抑制M1 巨噬細胞的極化[25]。此外，miR-122 被發現可激活巨噬細胞內TLR7 信號通路，導致巨噬細胞M1 極化，促進腫瘤壞死因子、白介素6、干擾素、白介素1 和一氧化氮合酶的表達，這也是肝功能不全所致急性肺炎癥和組織損傷的主要原因[26]。

4.2 HSFHSF1 是一種參與熱休克反應的轉錄因子，它調節熱休克蛋白如Hsp27、Hsp60 和Hsp70的轉錄，這些蛋白在肺部炎癥和損傷中發揮重要的細胞保護作用。有研究表明，HSF1 可以減輕LPS誘導的ALI 小鼠肺組織中巨噬細胞的浸潤，因為巨噬細胞浸潤受MCP-1 和CCR2 趨化因子的調節，HSF1 可通過降低MCP-1 及CCR2 的表達，從而抑制巨噬細胞浸潤，在LPS 誘導的ALI 小鼠中發揮保護作用[27]。

4.3 MMP-9MMP-9（或稱明膠酶B）屬于MMPs家族，在炎癥和腫瘤侵襲等病理過程中高度表達。MMP-9 是一種炎性細胞因子，其可在巨噬細胞中表達，在分泌炎性細胞因子中起著關鍵作用，可能與肺損傷的原因、潛在炎癥的動力學、其他MMP 的伴隨變化和/或MMP 的內源性抑制物[如金屬蛋白酶組織抑制物（TIMPs）]的活性有關。有研究表明，重組基質金屬蛋白酶-9 本身不影響極化標志物，但在脂多糖存在的情況下，重組基質金屬蛋白酶-9增加M1 標志物（IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS）的表達，降低脂多糖誘導的M2 標志物的變化（Arg-1、MRC-1、TGF-β、IL-10）[28]。

5 肺泡巨噬細胞的凋亡

肺部和全身炎癥之間的相互影響增強了肺部的炎癥過程，促進了ALI 的發展。新的證據顯示肺泡巨噬細胞的凋亡可影響肺部炎癥反應的進行[29，30]。炎癥反應可促進中性粒細胞向肺內遷移，增加肺泡內細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子α、β 的濃度，加重肺損傷的組織學表現，因此靶向影響AM 凋亡可能是控制肺部炎癥的一種治療策略[31]。外部因素可通過影響多個信號傳導通路來調節炎癥因子的分泌，進而促進肺泡巨噬細胞的凋亡，雙向調節素（AREG）是腫瘤微環境關鍵調節因子，AREG 和TNF-α 由肺組織及肺泡巨噬細胞同時產生，可通過EGFR 途徑直接抑制腫瘤壞死因子誘導的氣道上皮細胞（AECs）的凋亡和Caspase 死亡信號的轉導[32]。有研究表明，鐵死亡也可影響細胞自噬及凋亡，衣康酸酯可以通過抑制巨噬細胞的鐵死亡來減輕膿毒癥引起的ALI[33]。細胞存活取決于Bcl2與Bax，有研究表明，白藜蘆醇通過血管內皮生長因子-B 信號通路調節Bcl2/Bax 的表達，從而影響肺泡巨噬細胞的凋亡[34]。敗血癥誘導的ALI 的一種新的機制涉及中性粒細胞、巨噬細胞經歷細胞死亡，釋放核組蛋白導致組織損傷，從而加劇肺損傷。有研究證實，CitH3 多肽可刺激肺組織中Caspase-1的激活，并導致ALI[35]。

NLRP3 炎性小體可以激活一種巨噬細胞死亡的快速致炎形式，其特征是質膜破裂、胞漿內容物釋放和DNA 片段化，其可整合病原體觸發的巨噬細胞信號級聯反應，激活Caspase-1，并將前-IL-1β 和前-IL-18 蛋白分解為其成熟的細胞因子形式IL-1β 和IL-18，導致巨噬細胞DNA 損傷和嗜酸性細胞死亡。有研究表明A 組β 溶血性鏈球菌M1 蛋白是Caspase-1 依賴的NLRP3 炎性小體激活的第二信號，并通過一種未知的機制觸發鉀外流，調節巨噬細胞和嗜酸性粒細胞的死亡，加重組織損傷[36]，此外Caspase 11 在脂多糖誘導的巨噬細胞松弛中發揮重要作用，巨噬細胞松弛是一種由快速細胞裂解引起的程序性細胞死亡。

p-ERK 和p-JNK 是MAPK 的亞型，內毒素可使p-ERK 和p-JNK 激活增加，從而激活MAPK 信號通路，誘導相關途徑的細胞死亡，JMJD3 是一種JmjC 家族的組蛋白去甲基酶，是由微生物刺激引起的TLR 活化誘導的，可被MEK/MAP 激酶激活，JMJD3 可通過依賴于NF-κB 以及STAT 依賴的途徑來誘導，同時本身作為一個轉錄因子來誘導促炎細胞因子和趨化因子JMJD3 的表達增加，誘導促炎細胞因子的產生，影響線粒體膜的完整性，從而導致巨噬細胞凋亡，表觀遺傳修飾劑Aza 和TSA 可以抑制MAPK、JMJD3-STAT3 信號通路的活性，逆轉內毒素誘導的巨噬細胞線粒體膜電位變化和凋亡信號基因的釋放。以上研究是在骨髓來源的巨噬細胞上證實的，由此可推斷上述機制在膿毒癥引發的ALI 中也可能影響肺泡巨噬細胞凋亡[37]。

6 小結

ALI 是全身或肺部暴發性炎癥的結果，病原體通過激活包括巨噬細胞在內的白細胞來引發炎癥反應。肺泡巨噬細胞在宿主防御反應的前線發揮重要作用，肺泡巨噬細胞活化功能紊亂及下調被認為是ALI 的主要發病機制[38，39]，且這種凋亡是壞死性下調，如自分泌腫瘤壞死因子介導壞死性下調途徑，不利于炎癥清除[40]。巨噬細胞極化可以決定疾病的嚴重程度，可通過增強M2 巨噬細胞的極化以及減少肺泡巨噬細胞的壞死性下調抑制膿毒癥所致的ALI。糖酵解代謝雖被認為是巨噬細胞促炎免疫反應的重要驅動因素，然而考慮到巨噬細胞群體的多樣性和組織特異性，巨噬細胞可表現出明顯的異質性，研究表明，組織駐留的肺泡巨噬細胞不依賴糖酵解來治療內毒素誘導的炎癥，進一步印證了肺泡巨噬細胞極化及凋亡在對抗炎癥反應中的重要作用[41]，大量臨床病例及實驗數據表明，針對炎癥性疾病，需要對巨噬細胞的激活、極化進行精細控制，有些實驗方法可能無法清楚區分巨噬細胞與其他髓系細胞，這表明關鍵巨噬細胞亞群的功能差異被忽視。作為呼吸道中的主要巨噬細胞亞群，肺泡巨噬細胞通過清除碎片、表面活性物質和凋亡細胞，對維持肺的健康和功能至關重要[42]。因此，如果能夠實現精準調控巨噬細胞極化及凋亡，對膿毒癥所引起的ALI 的臨床治療將會有重要意義。