miR-34a與糖尿病腎病腎小管間質纖維化發病機制的研究進展▲

張顥曦 范曉蘭 楊 敏

(昆明醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，云南省昆明市 650101)

【提要】 糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發癥，而腎小管間質纖維化是糖尿病腎病主要的病理表現。在高糖環境中，miR-34a表達上調，并可通過靶向作用過氧化物酶體增殖物激活受體γ，調控轉化生長因子β1、結締組織生長因子、炎癥因子等以發揮其促纖維化作用。miR-34a還可以通過直接調控Klotho蛋白、沉默信息調節因子信號通路等發揮促纖維化作用，從而促進糖尿病腎病的進展。本文就miR-34a在糖尿病腎病腎小管間質纖維化中的作用機制研究進展進行綜述。

據統計，20%～40%的糖尿病患者會發展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，DN是糖尿病的主要微血管并發癥之一，也是終末期腎病的主要原因[1]。終末期腎病的病理特征是腎小球硬化、血管硬化、腎小管間質纖維化和腎小管萎縮，DN從早期開始就有不同程度的腎小管損傷，表現為腎小管基底膜增厚、腎小管炎性病變、腎小管萎縮、細胞凋亡增加、腎小管間質纖維化和腎小管周圍毛細血管變薄[2-3]。腎小管間質纖維化是導致腎衰竭的重要原因，表現為腎小管萎縮和細胞外基質蛋白(如纖連蛋白和膠原蛋白)的積聚，而上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是腎小管間質纖維化發生的主要原因[4]。

miRNA是內源性表達的小非編碼核糖核酸，通過與靶基因3′-非翻譯區的堿基進行完全或不完全配對來調節靶基因的表達，直接特異性降解和切割靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯，對基因表達起到負調節的作用，在細胞生長、分化、增殖和死亡中扮演重要角色[5-7]。研究表明，miR-34a對DN的發生、發展具有重要作用，miR-34a在2型糖尿病和DN患者中過表達，對腎小管間質纖維化具有調節作用[8-9]，但其通過調節腎小管間質纖維化從而影響DN進程的機制尚未完全明確。本文就miR-34a在DN腎小管間質纖維化發生中的作用機制的研究進展進行綜述。

1 miR-34a通過調控過氧化物酶體增殖物激活受體緩解腎小管間質纖維化

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是一種配體依賴性轉錄因子，目前已知有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三種亞型[10]。PPARγ主要富集在脂肪組織中，調控脂肪生成和脂質儲存過程，但其在許多非脂肪組織中也存在低水平表達的現象，包括腎臟和脈管系統[11]。在腎臟中，PPARγ可在所有類型的腎小球、腎小管和腎小管間質細胞中表達[12]。PPARγ經過翻譯后修飾(包括糖基化、磷酸化等)可參與調控多種生物進程，如調節葡萄糖代謝、胰島素敏感性、脂質代謝、纖維化、炎癥和氧化應激等[10，13]。研究表明，在高血糖狀態下，近端腎小管細胞中鈉-葡萄糖協同轉運蛋白(sodium-glucose cotransporter，SGLT)降低，減少了對葡萄糖的攝取，引起葡萄糖轉運功能障礙，并促進EMT，導致腎纖維化，而PPARγ激動劑可以恢復功能性SGLT介導的葡萄糖攝取，改善葡萄糖轉運功能，逆轉高血糖誘導的EMT過程，緩解腎纖維化[14]。PPARγ是miR-34a的直接靶基因，PPARγ的表達水平與miR-34a家族成員的表達水平和活化程度呈負相關[15]。miR-34a在DN患者中呈高表達水平，其不僅與高糖誘導的腎小管損害有關，還能通過直接靶向作用于PPARγ，影響腎小管間質纖維化[16-17]。PPARγ可與多種因子相互作用從而參與DN的腎小管間質纖維化，miR-34a對腎小管間質纖維化的影響或許與通過靶向PPARγ來調控相關因子有關。

1.1 PPARγ與轉化生長因子β1 轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可調節許多細胞行為，包括細胞增殖、分化、黏附和凋亡等[18]。TGF-β1作為一種促進纖維化的重要細胞因子，可抑制上皮表型所必需的基因(如上型鈣黏蛋白)的表達，并促進間充質表型所必需基因(如波形蛋白、膠原蛋白-1、N-鈣粘蛋白)和侵襲表型所必需的基因(如金屬蛋白酶) 的表達[19]。同時，TGF-β1還促進細胞外基質(如纖連蛋白和Ⅳ型膠原)的產生[20]。TGF-β1可通過誘導EMT過程促進腎小管間質纖維化[21]：一方面，TGF-β1可以從受損的上皮細胞轉移到肌成纖維細胞，表現為TGF-β1信號通過其細胞膜受體Ⅰ和Ⅱ傳導，激活并促其下游信號分子Smad2和Smad3發生磷酸化；磷酸化的Smad2/3與Smad 4(一種常見的Smad伴侶)異聚，形成的復合物轉移到細胞核中以調節靶基因的轉錄[22]；TGF-β1可誘導成纖維細胞中miR-34a表達上調，而miR-34a通過微泡的方式分泌并通過破裂的管狀基底膜輸送到管狀上皮細胞中，在管狀上皮細胞中通過p53轉錄下調抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2的表達，促進管狀上皮細胞的凋亡，導致腎小管萎縮，進而導致腎小管間質纖維化[23-24]。另一方面，EMT導致肌成纖維細胞數量顯著增加[25]，而肌成纖維細胞是分泌細胞外基質的間充質細胞的主要來源[26]，其可特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，α-SMA會導致細胞外基質過度積聚、腎小球硬化和腎小管間質纖維化，破壞腎臟的正常結構和功能[27]。研究表明，PPARγ激活劑(曲格列酮和羅格列酮)可降低葡萄糖誘導的腎臟TGF-β1高表達，同時還可以逆轉EMT過程，降低α-SMA的表達，抑制細胞外基質積聚，從而減輕腎間質纖維化[11，28]。

1.2 PPARγ與結締組織生長因子 結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是另一種促纖維化細胞因子，與DN的發生密切相關，在DN患者中呈高表達水平[29]。CTGF是TGF-β1誘導纖維化的下游介質之一[30]，CTGF通過血管性血友病因子C型結構域與TGF-β1結合，從而促進TGF-β1與相應受體結合，并通過TGF-β/Smad途徑促進細胞外基質蛋白(纖連蛋白和膠原蛋白)表達增加[31]。研究表明，PPARγ激活劑(曲格列酮和羅格列酮)可抑制CTGF基因的表達，從而抑制細胞外基質積聚，減輕腎間質纖維化[32]。

1.3 PPARγ與炎癥因子 持續炎癥反應引起的腎臟損傷是腎纖維化的起因，高血糖能誘導腎細胞產生各種炎癥因子[33]。細胞核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)被認為是糖尿病炎癥反應的主要轉錄因子，能調控巨噬細胞炎癥蛋白1、細胞間黏附分子1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等下游因子的表達水平。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是一種進化上保守的含鋅指的轉錄因子，能調節多種細胞過程，如細胞生長、增殖和分化等[34]。在DN中，NF-κB的激活可促使KLF4與炎癥細胞因子的啟動子(如IL-6)結合，增加炎癥細胞因子的轉錄，并且KLF4還可與NF-κB的p65亞單位相互作用，激活前炎癥細胞因子和觸發炎癥細胞因子的轉錄[35]。同時，高糖環境下TGF-β1表達水平增加，TGF-β1通過Smad和p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路直接誘導KLF4磷酸化，磷酸化的KLF4又能與Smad2相互作用，協同激活TGF-β-RI的啟動子，降低KLF4的表達水平[36]。研究表明，KLF4可通過抑制TGF-β1誘導的人腎小管細胞中MCP-1的產生來減輕炎癥反應和纖維化，M1型巨噬細胞持續激活或M2型巨噬細胞活化不足時，機體內促炎因子大量分泌，形成慢性炎癥，MCP-1通過MCP-1/C-C基序趨化因子受體2途徑減少促炎(M1)型巨噬細胞的募集及MCP-1的產生，從而減輕炎癥反應和纖維化，但對TGF-β1介導的纖連蛋白和膠原蛋白的表達無影響[37-39]。此外，KLF4還可與Smad3直接相互作用，抑制肌成纖維細胞分化，減少細胞外基質的堆積，緩解腎間質纖維化[40]。PPARγ激動劑(吡格列酮)可通過抑制高糖誘導的NF-κB的激活及外周組織炎癥細胞因子的釋放，促進抗炎(M2)型巨噬細胞轉錄表達，減輕炎癥反應，減少腎小管上皮細胞凋亡，增強胰島素敏感性；PPARγ激動劑(羅格列酮)還可劑量依賴性地降低晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)誘導ICAM-1的表達來減輕炎癥反應，緩解纖維化[11,35]。

2 miR-34a通過調控Klotho蛋白和沉默信息調節因子緩解腎小管間質纖維化

2.1 Klotho蛋白 Klotho蛋白主要在腎小管上皮細胞中表達，最初被稱為抗衰老蛋白，降低Klotho蛋白的表達水平可加速腎小管上皮細胞向促纖維化表型轉化，并促進成纖維細胞的增殖，而上調Klotho蛋白的表達水平可以通過抑制NF-κB通路相關的炎癥細胞因子、趨化因子和生長因子的生成，抑制纖維化，保護腎臟[41]。Klotho蛋白可分為膜型Klotho蛋白和分泌型Klotho蛋白兩種形式。分泌型Klotho蛋白可直接與TGF-β受體Ⅱ結合，并抑制TGF-β1與細胞表面受體結合，從而抑制TGF-β1信號，減輕EMT，緩解腎間質纖維化[42]。此外，Klotho蛋白作為鈣穩態的調節因子，可能通過抑制足細胞中磷脂酰基醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)依賴性的胞吐作用，抑制瞬時受體電位陽離子通道亞家族C成員6介導的Ca2+內流，從而改善蛋白尿和腎纖維化[43-44]。胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是胰島素信號傳導的關鍵調節因子，Klotho蛋白可抑制IRS-1/PI3K/蛋白激酶B信號通路來降低α-SMA、纖連蛋白的表達水平，促進抗氧化因子的表達，減輕腎臟的損傷[44]。研究表明，miR-34a可通過直接結合Klotho蛋白基因中的3′-非翻譯區來下調Klotho蛋白的表達水平，并誘導α-SMA和纖連蛋白的表達，抑制上皮型鈣黏蛋白的表達，從而促進腎小管纖維化[8]。此外，PPARγ激活劑可通過誘導Klotho蛋白的表達，抑制腎纖維化，減緩慢性腎臟病的進展[45]。但值得注意的是，miR-34a表達水平的異常升高并不是Klotho蛋白表達減少的唯一影響因素。

2.2 沉默信息調節因子 沉默信息調節因子(silent information regulator T1，SIRT1)屬于NAD+依賴性脫乙酰酶的高度保守家族，參與許多重要的生物學過程，包括炎癥反應、腎間質纖維化、缺氧條件下的自噬、衰老和氧化應激等[46]。研究表明，miR-34a可以通過結合靶基因的3′-非翻譯區以轉錄后抑制SIRT1的表達[47]，而沉默SIRT1可促進其下游分子缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表達，HIF-1α又可通過低氧應答元件與多種靶基因(如膠原脯氨酰4羥化酶1、膠原脯氨酰4羥化酶2和前膠原賴氨酸)的啟動子結合，激活某些EMT調節因子，促進腎纖維化的發展[9,23]。

高血糖不僅可導致活性氧的過量產生、AGEs的形成和AGEs受體的激活，還可促進NF-κB、血管內皮生長因子、TGF-β1的產生，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進而誘導各種炎癥細胞因子的產生和線粒體活性氧的產生，進一步加重腎臟的氧化應激反應。而SIRT1表達降低時TGF-β1表達顯著增加，SIRT1可通過TGF-β 1/Smad信號通路調控成纖維細胞的活化和組織纖維化[18]。此外，SIRT1還被證實在保護細胞免受細胞氧化應激和DNA損傷方面起著重要作用[48]。叉頭轉錄因子O1 (forkhead transcription factor O1，FOXO1)是包含叉頭盒的轉錄因子O家族的成員。SIRT1可通過SIRT1/FOXO1信號通路促進FOXO1自身的表達，增強其轉錄活性，從而誘導自噬，減少氧自由基對腎臟的損傷，發揮抗氧化能力[46]。此外，過表達的FOXO1通過與啟動子直接結合，抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)和促進硫氧還蛋白(thioredoxin protein，TRX)的表達，TXNIP和TRX進一步相互作用以維持氧化應激平衡；SIRT1表達水平升高可通過TXNIP/TRX途徑促使FOXO1表達上調，而增加FoxO1的表達水平可降低活性氧水平，減少腎小管細胞凋亡，改善纖維化[49]。還有研究表明，SIRT1和PPARγ輔活化因子1α(PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)是線粒體功能的主要調節因子，SIRT1/PGC-1α信號通路是抗氧化損傷的重要內源性通路之一，PGC-1α可被SIRT1激活并參與多種生物學途徑，如細胞凋亡、能量代謝、氧化應激等，PGC-1α的高表達可促進參與線粒體DNA轉錄和線粒體呼吸鏈調節的多個核編碼基因的表達，減少活性氧的合成[50]。PPARγ 激動劑(羅格列酮)可能通過誘導PGC-1α的表達，維持線粒體功能和減少活性氧的產生，從而減輕炎癥反應，緩解腎纖維化，同時還可以與改善DN相關的足細胞損傷及腎小球基底膜增厚[51]。

3 小 結

miR-34a在DN腎小管間質纖維化的發生和發展過程中具有重要作用，高糖環境下miR-34a的過表達能夠通過抑制PPARγ導致腎小管間質纖維化。miR-34a不僅能通過直接作用于PPARγ激活TGF-β/Smad經典途徑引起EMT導致腎間質纖維化，還可通過調控炎癥反應、氧化應激等發揮促纖維化作用。此外，miR-34a還可以通過調控Klotho及SIRT1信號通路導致腎小管間質纖維化，但具體機制仍需進一步研究。深入研究miR-34a對腎小管間質纖維化的相關作用機制，有望為DN提供新的治療靶點。