母親孕期同型半胱氨酸、葉酸及相關(guān)基因多態(tài)性與子代發(fā)生先天性心臟病的關(guān)系

段素霞 趙夢川 張麗霞 趙紫薇 陶曙光 金立臣 宋海龍 崔曉薇 李貴霞

先天性心臟病(congenital heart disease, CHD)是指胎兒在宮內(nèi)發(fā)生的心臟或大血管結(jié)構(gòu)異常而引起的先天性心血管畸形，是一種最常見的出生缺陷，其發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中為0.05%～13.8%[1]。已知的CHD病因除少數(shù)是由單基因突變或染色體畸變外，大多數(shù)的CHD被認(rèn)為是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果[2-4]。大量研究結(jié)果提示，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥可能與CHD的發(fā)生有關(guān)，而葉酸與Hcy的代謝密切相關(guān)，葉酸缺乏可使Hcy水平增高[5]。參與葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的關(guān)鍵酶包括5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase, MTHFR)，蛋氨酸合成酶(methionine synthase, MS)以及蛋氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase, MTRR)等。有研究認(rèn)為以上基因多態(tài)性位點(diǎn)突變可以通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致相應(yīng)酶的活性減弱，從而直接或間接影響體內(nèi)葉酸和Hcy水平，進(jìn)一步干擾胚胎期心血管和神經(jīng)等發(fā)育[6-8]。針對(duì)母親Hcy以及葉酸水平與CHD、唇腭裂、染色體異常等多種出生缺陷的關(guān)系研究已見報(bào)道[6-9]，但對(duì)母親在妊娠時(shí)體內(nèi)的血清Hcy及紅細(xì)胞葉酸水平聯(lián)合相關(guān)基因多態(tài)性來分析其與子代發(fā)生CHD的相關(guān)研究尚少見。本研究通過檢測孕有CHD胎兒孕婦與正常妊娠孕婦的血清Hcy、紅細(xì)胞葉酸水平及MTHFR-C677T和A1298C位點(diǎn)、MS-A2756G及MTRR-A66G位點(diǎn)的基因多態(tài)性，來進(jìn)一步分析其與子代CHD發(fā)生的相關(guān)性，為預(yù)防CHD提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2018年6月至2019年12月在河北省兒童醫(yī)院胎兒先天性心臟病篩查中心就診的22～30孕周的單胎孕婦共107例。根據(jù)是否妊娠CHD胎兒，將研究對(duì)象分為CHD組(n=52)和正常妊娠組(n=55)。CHD組是指經(jīng)B超診斷為妊娠CHD胎兒的孕婦，正常妊娠組選取同期經(jīng)B超及其他產(chǎn)前篩查診斷為胎兒發(fā)育正常的孕婦。本研究經(jīng)河北省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意(醫(yī)研倫審第202120號(hào))。CHD組年齡20～38歲，中位年齡28歲；平均孕周(25.3±1.1)周。正常妊娠組年齡21～37歲，中位年齡27歲;平均孕周(25.7±0.9周)。2組年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 本研究納入的孕婦均接受B超檢查及必要的產(chǎn)前檢查，排除了妊娠期高血壓、糖尿病等疾病，無放射線接觸史，無不良嗜好。

1.3 方法 本研究第一時(shí)間收集其已完成臨床檢測的剩余EDTA-K2抗凝全血及經(jīng)分離膠管離心后分離的血清樣本。采用血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取了樣本的全血DNA，凍存于-80℃冰箱備用。

1.3.1 血清Hcy及紅細(xì)胞葉酸的測定：采用酶循環(huán)法檢測血清Hcy，檢測儀器為Cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀(德國羅氏公司)，試劑盒由北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司提供，嚴(yán)格按照說明書操作。EDTA-K2抗凝全血樣本依據(jù)葉酸測定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)說明書(美國西門子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司)進(jìn)行處理，在ADVIA Centaur CP 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國西門子公司)上進(jìn)行紅細(xì)胞葉酸的測定。

1.3.2 四個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測：以上4個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)均采用PCR后Sanger測序的方法進(jìn)行檢測。采用TaKaLa Ex Taq Hot Start Version(大連寶生物工程有限公司)的PCR試劑盒，配置25 μl的PCR反應(yīng)體系，其中包含無核酶水16.375 μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μl，dNTP 2 μl，Taq酶0.125 μl，最后加入設(shè)計(jì)好的相應(yīng)上下游引物各1 μl(10 μmol/L)(引物序列見表1)，模板2 μl(50～150 ng/μl)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；進(jìn)入循環(huán)：95℃變性30 s，60℃ 45 s，50個(gè)循環(huán)；最后4℃保存。對(duì)2組樣本PCR后進(jìn)行Sanger測序(上海生工生物工程股份有限公司)，根據(jù)測序結(jié)果判讀樣本的四個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型。見表1。

表1 四個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 孕婦血清Hcy、紅細(xì)胞葉酸與子代發(fā)生CHD的關(guān)系 CHD組血清Hcy水平(P50=7.85 μmol/L)顯著高于正常妊娠組(P50=5.89 μmol/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.45，P=0.01)。2組紅細(xì)胞葉酸水平(1 968.44 nmol/L vs 1 733.50 nmol/L)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.64，P=0.10)。

2.2 母親基因多態(tài)性位點(diǎn)與其子代發(fā)生CHD的相關(guān)性 2組標(biāo)本的四個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布均符合HWE定律，說明其等位基因及基因型頻率在人群中的遺傳是恒定的，樣本代表性良好。將CHD組與正常妊娠組孕婦的四個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)分布情況進(jìn)行比較，對(duì)于MTHFR-C677T位點(diǎn)，攜帶突變型等位基因T導(dǎo)致子代的CHD患病風(fēng)險(xiǎn)是攜帶野生型等位基因C個(gè)體的2.56倍(95% CI：1.47～4.47，P<0.001)。與野生型純合子CC比較，攜帶雜合子CT的母親其子代患CHD的風(fēng)險(xiǎn)較高(OR=5.37，95% CI：1.59～18.11，P=0.004)，突變型純合子TT母親其子代患CHD的風(fēng)險(xiǎn)是CC個(gè)體的8.04倍(95% CI：2.24～28.85，P<0.001)。MTHFR-A1298C、MS-A2756G和MTRR-A66G位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在2組中分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 2組孕婦4個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的HWE遺傳平衡檢驗(yàn)

表3 母親4個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)與子代發(fā)生CHD的關(guān)系

3 討論

Hcy是蛋氨酸代謝產(chǎn)生的一種含硫氨基酸，具有細(xì)胞毒性，可使巰基氧化產(chǎn)生自由基，引起細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為Hcy可通過氧化應(yīng)激直接對(duì)胚胎產(chǎn)生毒性作用，其產(chǎn)生的S-腺苷蛋氨酸還可干擾甲基化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生錯(cuò)誤蛋白和無功能蛋白[10]，Rosenquist等[11]發(fā)現(xiàn)給雞胚注射Hcy可誘發(fā)其發(fā)生室間隔缺損等多種心臟畸形。本研究顯示，孕有CHD患兒的孕婦其血清Hcy水平明顯高于正常妊娠組，提示母親孕期的血清Hcy水平升高可能是子代CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

葉酸在細(xì)胞的生長和分裂中有著重要的生理作用，與Hcy的代謝密切相關(guān)[12]。血清葉酸和紅細(xì)胞葉酸水平是衡量機(jī)體葉酸營養(yǎng)狀況最常用的兩項(xiàng)指標(biāo)。血清葉酸水平反映機(jī)體葉酸水平的早期變化，受近期膳食及吸收狀況的影響較大，而紅細(xì)胞葉酸水平則代表機(jī)體內(nèi)肝臟等組織中葉酸的貯存情況，相對(duì)穩(wěn)定并且代表了體內(nèi)參與代謝過程的葉酸水平[13，14]。目前針對(duì)此類研究的報(bào)道中，機(jī)體葉酸的測定指標(biāo)均采用血清葉酸水平展開，而本研究則選取了代表性更好的紅細(xì)胞葉酸水平。同時(shí)，以往的研究大多針對(duì)CHD患者或是已生育CHD患兒的母親展開，認(rèn)為葉酸水平降低是CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素[15,16]；筆者發(fā)現(xiàn)對(duì)母親孕期中的葉酸水平與子代發(fā)生CHD的相關(guān)研究尚少見。本研究對(duì)2組處于孕期的母親其紅細(xì)胞葉酸水平進(jìn)行了測量比較，并沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。推測母親孕期的紅細(xì)胞葉酸水平與子代發(fā)生CHD的關(guān)聯(lián)性較小，這可能是由于地域的差異、生活水平的提高或母親孕期的飲食等在一定程度上補(bǔ)充了葉酸所致。

MTHFR是參與Hcy和葉酸代謝的關(guān)鍵酶之一。有研究發(fā)現(xiàn)，母親MTHFR-C677T基因多態(tài)性與子代發(fā)生神經(jīng)管缺陷、流產(chǎn)及CHD的概率有顯著的相關(guān)性[17-19]。本研究結(jié)果表明，與野生型純合子CC比較，攜帶雜合子CT的母親其子代患CHD的風(fēng)險(xiǎn)較高(OR=5.37)，而攜帶突變型純合子TT的母親其子代患CHD的風(fēng)險(xiǎn)則更為顯著，是CC個(gè)體的8.04倍，推測母親純合型突變對(duì)子代CHD的致病力可能大于雜合型突變。母親攜帶突變型等位基因T可能是子代發(fā)生CHD的危險(xiǎn)因素，該結(jié)論與多數(shù)國內(nèi)外的研究觀點(diǎn)[8,17]相符。

目前對(duì)于MTHFR A1298C位點(diǎn)的研究大部分集中于患兒本身，且結(jié)論存在爭議。李棟等[18]在對(duì)150名CHD患兒進(jìn)行的病例-對(duì)照研究中認(rèn)為突變型等位基因C是CHD的危險(xiǎn)因素。而Hobbs 等[8]在一篇對(duì)美國中南部人群的研究中卻認(rèn)為該等位基因C為CHD的保護(hù)因素。針對(duì)母親MTHFR A1298C位點(diǎn)、MS-A2756G及MTRR-A66G位點(diǎn)與子代發(fā)生CHD的研究較為少見，本研究尚未發(fā)現(xiàn)母親以上3個(gè)位點(diǎn)對(duì)子代CHD的發(fā)生有影響。

綜上所述，CHD病因復(fù)雜，是環(huán)境與遺傳相互作用的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)母親孕期血清Hcy水平升高及MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因T可能是子代CHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。但最終結(jié)論尚需依賴基礎(chǔ)研究和大規(guī)模前瞻性人群調(diào)查，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和精準(zhǔn)預(yù)防的推進(jìn)，該研究可為出生缺陷的預(yù)防和評(píng)估提供一定的指導(dǎo)價(jià)值和參考意義。