馬錢苷元對白血病HL-60細胞生長及TGF-β1表達的影響

陳相言 劉徽 楊歡

白血病是造血系統(tǒng)常見惡性腫瘤，感染、免疫功能異常、遺傳、病毒、輻射等均可能與白血病的發(fā)生有關(guān)[1]。白血病的發(fā)生機制較為復(fù)雜，骨髓造血干細胞移植、聯(lián)合化療等是治療的有效途徑，但目前白血病患者5年的生存率仍然≤50%[2]。中藥具有來源廣泛、容易獲取等優(yōu)點，現(xiàn)階段已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。馬錢苷是從山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類，也是山茱萸含量最高的活性成分，具有多種藥理學(xué)作用，對阿爾茨海默病、糖尿病、腫瘤等均有改善功效，馬錢苷脫去一分子的葡萄糖后產(chǎn)生馬錢苷元，馬錢苷元具有消炎等功效[3-5]。近年有報道顯示，馬錢苷元能夠在體外抑制胰腺癌的進展，降低胰腺癌細胞增殖能力[6]。中藥抗腫瘤機制較為復(fù)雜，其可以通過作用于細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用[7]。Hedgehog信號在人體內(nèi)的作用極為廣泛，參與細胞生長、胚胎發(fā)育等過程，對疾病進展也有調(diào)控功能[8]。在腫瘤中已經(jīng)證明Hedgehog過度激活，而抑制Hedgehog信號能夠降低腫瘤惡性生長能力[9]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)有調(diào)控細胞生長、凋亡等作用的能夠誘導(dǎo)白血病細胞凋亡和增殖抑制[10]。本實驗探討馬錢苷元對白血病細胞增殖、周期、凋亡和TGF-β1表達影響及相關(guān)機制，為臨床應(yīng)用提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞周期依賴性激酶抑制因子(p21)抗體購自美國 Santa Cruz Biotechnology；B淋巴細胞瘤-2關(guān)聯(lián)X的蛋白(Bax)抗體購自美國Cell Signaling Technology；TGF-β1抗體購自南京歐凱生物科技有限公司；Gli2抗體購自美國Proteintech；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體購自上海晅科生物科技有限公司；Smo抗體購自美國Abcam；馬錢苷元購自成都植標化純生物技術(shù)有限公司；白血病HL-60細胞購自上海美軒生物科技有限公司；Hedgehog信號通路激活劑(Purmorphamine，PM)購自美國Selleck。

1.2 細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)實驗檢測馬錢苷元對白血病HL-60細胞增殖影響 白血病HL-60細胞接種到96孔板內(nèi)，細胞接種密度為2×103個/孔，每個孔內(nèi)添加150 μl的細胞培養(yǎng)液，根據(jù)實驗需要分別將細胞分成對照組和馬錢苷元組，其中對照組中添加0 μmol/L的馬錢苷元，馬錢苷元組分成30、60、120、240 μmol/L濃度梯度，將細胞培養(yǎng)板放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)板取出，分別在每個孔中添加CCK-8溶液，在37℃孵育2 h以后，立即用酶標儀檢測，檢測波長設(shè)置為450 nm。結(jié)果以O(shè)D值表示細胞增殖能力。

1.3 碘化丙啶(PI)單染法檢測馬錢苷元對白血病HL-60細胞周期影響 取生長至對數(shù)期的白血病HL-60細胞，按照對照組(0 μmol/L馬錢苷元)、馬錢苷元組(60、120、240 μmol/L馬錢苷元)分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 以后，收集細胞，以PBS將細胞洗滌2次，然后添加70%的乙醇，在4℃過夜反應(yīng)，然后將上清溶液棄掉，以PBS洗滌細胞。在細胞內(nèi)加入500 μl的染液(含有25 μl的PI以及10 μl的RNase)，放在37℃孵育30 min，立即用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.4 異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素V(Annexin V-FITC)/PI雙染法檢測馬錢苷元對白血病HL-60細胞凋亡影響 取生長至對數(shù)期的白血病HL-60細胞，按照對照組(0 μmol/L馬錢苷元)、馬錢苷元組(60、120、240 μmol/L馬錢苷元)分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后，收集細胞，以PBS將細胞洗滌2次，在細胞中添加500 μl的結(jié)合緩沖液，然后添加PI以及Annexin V-FITC溶液各5 μl，在室溫下避光反應(yīng) 20 min。上流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.5 Western blot檢測p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smo、Gli2蛋白表達影響 取生長至對數(shù)期的白血病HL-60細胞，按照對照組(0 μmol/L馬錢苷元)、馬錢苷元組(60、120、240 μmol/L馬錢苷元)分組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后，收集細胞，在細胞中分別加入蛋白抽提試劑(含PMSF的RIPA)，置于冰上裂解反應(yīng)20 min后，將裂解溶液收集，于4℃，12 000 g離心10 min，小心取蛋白上清液，按照BCA方法分析蛋白濃度。在剩余的蛋白樣品內(nèi)分別添加5×Loading Buffer，均勻混合，在100℃環(huán)境中孵育15 min。SDS-PAGE凝膠上樣孔中按照30 μg蛋白/孔添加樣品，本次SDS-PAGE凝膠為5%的濃縮膠、10%的分離膠，在濃縮膠內(nèi)采用80 V的電壓進行電泳，肉眼看到藍色染料進入到分離膠之后，立即換成100V繼續(xù)電泳，觀察染料已經(jīng)達到凝膠的底部之后，終止電泳，取出凝膠。把凝膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)浸泡10 min。將轉(zhuǎn)膜電壓調(diào)整為70 V，轉(zhuǎn)膜時間設(shè)置為40 min，轉(zhuǎn)膜裝置需要置于冰上進行。轉(zhuǎn)膜結(jié)束以后，將NC膜取出，放在5%的脫脂奶粉溶液中將非特異性的結(jié)合位點封閉后，置于1∶1 000稀釋之后的一抗反應(yīng)液內(nèi)，于4℃的環(huán)境過夜反應(yīng)，最后把NC膜置于1∶4 000稀釋后的二抗內(nèi)，置于室溫內(nèi)結(jié)合反應(yīng)2 h。然后在NC膜上小心滴加ECL顯色試劑進行顯色。GAPDH為參照，分析p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smo、Gli2蛋白的表達變化。

1.6 Hedgehog信號通路激活劑對馬錢苷元影響白血病HL-60細胞的作用檢測 取生長至對數(shù)期的白血病HL-60細胞，用含有240 μmol/L馬錢苷元和0.8 μmol/L的Hedgehog信號通路激活劑PM細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)，記為馬錢苷元+PM組，以馬錢苷元組(240 μmol/L馬錢苷元)為參照，按照1.2中CCK-8方法檢測細胞增殖變化，1.3中PI單染法檢測細胞周期變化，1.4中Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡變化，按照1.5中Western blot方法檢測細胞中p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smo、Gli2蛋白表達變化。

2 結(jié)果

2.1 馬錢苷元對白血病HL-60細胞增殖影響 與對照組(0 μmol/L)比較，30 μmol/L的馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞OD值沒有變化，60、120、240 μmol/L的馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞OD值降低(P<0.05)。選擇60、120、240 μmol/L的馬錢苷元進行后續(xù)研究。見表1。

表1 4組白血病HL-60細胞OD值變化

2.2 馬錢苷元對白血病HL-60細胞周期和凋亡影響 與對照組(0 μmol/L)比較，60、120、240 μmol/L的馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞G0/G1比例，細胞凋亡率，細胞中p21、Bax蛋白表達水平逐漸升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 馬錢苷元對白血病HL-60細胞凋亡和細胞中p21、Bax、Bcl-2表達影響；A 流式細胞術(shù)測定白血病HL-60細胞凋亡變化；B Western blot檢測白血病HL-60細胞中p21、Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 不同馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞周期分布、細胞凋亡率和細胞中p21、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

2.3 馬錢苷元對白血病HL-60細胞中TGF-β1蛋白表達影響 與對照組(0 μmol/L)比較，60、120、240 μmol/L的馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞TGF-β1蛋白表達水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 Western blot方法檢測不同馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞TGF-β1蛋白水平

表3 不同馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞TGF-β1蛋白水平比較

2.4 馬錢苷元對白血病HL-60細胞Hedgehog信號通路影響 與對照組(0 μmol/L)比較，60、120、240 μmol/L的馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞Smo、Gli2蛋白表達水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 Western blot檢測不同馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞中Smo、Gli2蛋白表達變化

表4 不同馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞Smo、Gli2蛋白水平比較

2.5 Hedgehog信號通路激活劑PM促進白血病HL-60細胞中Hedgehog信號通路激活 與馬錢苷元組比較，馬錢苷元+PM組白血病HL-60細胞中Smo、Gli2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western blot方法檢測Hedgehog信號通路激活劑PM對馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞中Smo、Gli2蛋白表達影響

表5 Hedgehog信號通路激活劑PM和馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞Smo、Gli2蛋白水平比較

2.6 激活Hedgehog信號對馬錢苷元影響白血病HL-60細胞增殖、周期、凋亡的作用 與馬錢苷元組比較，馬錢苷元+PM組白血病HL-60細胞OD值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義細胞G0/G1比例降低，細胞凋亡率降低，細胞中p21、Bax、TGF-β1蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Hedgehog信號通路激活劑PM對馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞凋亡和細胞中p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1表達影響；A 流式細胞術(shù)測定白血病HL-60細胞凋亡變化；B Western blot檢測白血病HL-60細胞中p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1蛋白表達

表6 Hedgehog信號通路激活劑PM和馬錢苷元處理后白血病HL-60細胞OD值、周期分布、細胞凋亡率和細胞中p21、Bax、Bcl-2、TGF-β1蛋白水平比較

3 討論

馬錢苷元易溶于水，能夠改善組織炎癥[11]，既往研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷對胃癌細胞有抑制作用[12]，還能夠在體外誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[5]。馬錢苷元對體外胰腺癌細胞惡性生長具有抑制功效[6]。本實驗顯示，馬錢苷元處理后的白血病細胞增殖活性降低，細胞凋亡率升高，說明馬錢苷元具有抗白血病細胞的作用。

細胞周期是指從上一次有絲分裂結(jié)束到本次有絲分裂結(jié)束的整個過程，細胞周期是細胞增殖的基礎(chǔ)[13]。細胞周期有序進展受到細胞內(nèi)多個調(diào)控因子的調(diào)節(jié)作用，細胞從G0/G1向S期進展是目前發(fā)現(xiàn)的細胞周期中的關(guān)鍵調(diào)控點[14]。當(dāng)細胞周期抑制因子如p21表達水平升高后，細胞周期被阻滯[15]。細胞增殖和細胞凋亡是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分，腫瘤細胞增殖速度過快而凋亡減少是腫瘤惡性進展的關(guān)鍵[16]。細胞凋亡與細胞周期一樣，均受到細胞內(nèi)多種基因的表達調(diào)控作用，Bcl-2是現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的與細胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其蛋白家族成員被分成促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分別在細胞凋亡進展中發(fā)揮促進作用和抑制作用[17]。Bax、Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族，前者是促凋亡蛋白，后者是抗凋亡蛋白，Bax升高、Bcl-2降低意味著細胞凋亡進程加快[18]。TGF-β1具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細胞增殖、外基質(zhì)合成等作用，與腫瘤進展有關(guān)[19]。在白血病中發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達下調(diào)，而TGF-β1能夠誘導(dǎo)白血病細胞凋亡，抑制細胞增殖，TGF-β1上調(diào)白血病細胞中Bax蛋白表達水平，降低Bcl-2蛋白表達水平[10]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，馬錢苷元作用后的白血病細胞凋亡水平升高，細胞增殖能力降低，細胞G0/G1比例升高，Bax蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，TGF-β1蛋白表達也增多，這說明馬錢苷元可能通過促進TGF-β1表達誘導(dǎo)白血病細胞凋亡，抑制細胞增殖，阻滯細胞周期。

既往報道顯示，中藥抗腫瘤機制與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)，其作用于細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細胞生長[20]。Hedgehog信號通路組成較為復(fù)雜，由轉(zhuǎn)錄因子、膜蛋白受體復(fù)合物等組成，Smo是Hedgehog的配體，激活后的Smo能夠誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達，Hedgehog信號在細胞凋亡、胚胎發(fā)育進程中發(fā)揮十分重要的作用[21]。有研究顯示，Hedgehog信號與腫瘤進展有關(guān)，白血病細胞中Hedgehog信號過度激活，而抑制Hedgehog信號能夠降低白血病細胞惡性程度[22]。本實驗顯示，馬錢苷元作用后的白血病細胞中Smo、Gli2蛋白表達水平降低，并且Hedgehog信號激活劑能夠逆轉(zhuǎn)馬錢苷元對白血病細胞增殖抑制、周期阻滯、凋亡促進和促TGF-β1表達作用，提示馬錢苷元通過Hedgehog信號發(fā)揮抗白血病作用。

總而言之，馬錢苷元能夠在體外通過降低Hedgehog信號激活水平抑制白血病細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，阻滯細胞周期，促進TGF-β1表達，馬錢苷元可能是未來白血病治療的途徑。