miR-452-5p調控YTHDF2肝細胞癌細胞凋亡和鐵死亡的機制研究

王雪梅

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發性肝癌的主要類型(>85%)，其病死率位居世界第二，近幾年肝細胞癌的新發病例數和死亡數逐年增長，尤其在中國[1]。對于肝細胞癌早期的患者進行肝臟切除、肝移植或局部消融有助于患者的預后，而晚期或肝硬化患者的預后很差[2]。微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼的內源保守的18～22個核苷酸之間的RNA片段，通過調控靶基因的轉錄、翻譯而抑制蛋白的表達，以此參與人類幾乎所有疾病的發展[3]。miR-452-5p為眾多新發現的miRNA之一[4]。m6A作為真核細胞mRNA上最常見的內部修飾之一，對基因的表達十分重要[5]。YTH結構域家族2(YTH domain family ,member 2，YTHDF2)是最有效的m6A結合蛋白，可通過結合含有m6A的結合位點的基因以削弱其穩定性[6]。最新報道顯示，YTHDF2能夠降解腫瘤啟動子并抑制癌基因的mRNA表達[7]。鐵死亡是近年提出的一種調節性細胞死亡方式，主要依賴于細胞內鐵和脂質活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累所引起的細胞死亡[8]。本研究旨在探索miR-452-5p、YTHDF2調節肝細胞癌細胞凋亡、鐵死亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B細胞購自美國菌種保藏中心；活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)購自北京百奧萊博公司；細胞計數試劑盒(cell counting Kit，CCK8)購自日本同仁；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天；細胞免疫熒光法檢測細胞中ROS含量；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega；所有miR-con、miR-452-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-452-5p及引物的設計合成均委托上海吉瑪公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B細胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃恒溫細胞培養箱中培養。培養箱中含有5%CO2、95%O2的飽和濕度氣體環境中。每2 天更換1次培養液。

1.2.2 細胞轉染與分組：將正常培養至對數生長的細胞設為L02組、SMMC-7721組、HepG2組、Huh7組、Hep3B組。將不做任何處理的HepG2細胞設為NC組；使用脂質體LipofectamineTM3000將anti-miR-con組(轉染anti-miR-con)、anti-miR-452-5p組(轉染anti-miR-452-5p)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-YTHDF2組(轉染pcDNA-YTHDF2)、anti-miR-452-5p+si-con組(共轉染anti-miR-452-5p 和si-con)、anti-miR-452-5p+si-YTHDF2組(共轉染anti-miR-452-5p 和si-YTHDF2)轉染HepG2細胞12 h，繼續培養48 h，RT-qPCR或WB實驗檢測轉染是否成功。確認成功后用于后續研究，否則繼續更換轉染條件至成功。

1.2.3 RT-qPCR實驗：收集需要檢測的細胞，Trizol液提取總RNA，反轉錄試劑盒將其合成cDNA，-20℃保存，作為模板備用。用RT-qPCR試劑盒檢測模板中miR-452-5p、YTHDF2的表達。以U6、GAPDH為內參，2-△△Ct法計算miR-452-5p、YTHDF2的表達水平。擴增程序設置為：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s，進行45個循環，72℃，保存5 min。引物信息：miR-452-5p，上游引物5’-AAGAGGGCATGGAAACACTG-3’，下游引物5’-ACTCACCCCATTCTTCAAGG-3’；YTHDF2，上游引物 5’-GCTTGCCTGCTACATAGTGAGA-3’，下游引物5’-AACTGAACTGCTTAACCTTCTGG-3’。U6、GAPDH所用為通用引物。

1.2.4 ROS含量檢測：收集細胞，PBS充分洗滌。按照活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)的說明書要求逐步操作，加入DCFH-DA，避光孵育30 min，用酶標儀在480 nm激發波長/530 nm發射波長處檢測熒光強度，熒光顯微鏡下拍照細胞的熒光圖。

1.2.5 WB實驗：細胞中加入足夠量的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。然后對蛋白定量、變性，SDS-PAGE蛋白電泳。用轉膜儀將蛋白轉移到NC膜，再用含2.5%脫脂奶粉的封閉液對膜37℃封閉處理2 h。將膜浸泡再稀釋過的一抗稀釋液中，4℃孵育過夜，充分洗膜。再浸泡在稀釋的二抗溶液中37℃孵育2 h，充分洗膜。最后，用ECL發光液顯影曝光。

1.2.6 CCK8實驗：收集待檢細胞，用培養液調至5×104個/ml，取200 μl置于96孔板，再加入10 μl的CCK8反應液，避光孵育20 min。在490 nm波長下檢測細胞的吸光度。細胞活性(%)=OD490實驗組/OD490對照組×100。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測實驗：收集待檢測的細胞，充分洗滌5次，再用500 μl結合緩沖液懸浮細胞。依次加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI避光反應10 min，上流式細胞儀分析細胞的凋亡。總凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗：生物信息學靶點預測網站Starbase(https://starbase.sysu)預測miR-452-5p的靶位點，發現YTHDF2的3’UTR與miR-452-5p存在連續的結合位點。化學合成YTHDF2-WT(含YTHDF2 3’UTR)和YTHDF2-MUT(不含YTHDF2 3’UTR)，并將其插入熒光載體，構建熒光報告基因載體。YTHDF2-WT和YTHDF2-MUT報告載體分別與miR-con、miR-452-5p、anti-miR-con、anti-miR-452-5p共轉染基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性。

2 結果

2.1 肝細胞癌細胞中miR-452-5p和YTHDF2的表達 與L02組比較，SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B組miR-452-5p表達升高(P<0.05)，YTHDF2 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 YTHDF2蛋白電泳圖

表1 miR-452-5p和YTHDF2在L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7和Hep3B細胞中的表達

2.2 抑制miR-452-5p調節HepG2細胞增殖 與anti-miR-con組比較，anti-miR-452-5p組HepG2細胞miR-452-5p表達和細胞活性均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 抑制miR-452-5p的HepG2細胞增殖

2.3 抑制miR-452-5p對HepG2細胞的凋亡、鐵死亡的調控 與anti-miR-con組比較，anti-miR-452-5p組HepG2細胞凋亡率、ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-452-5p的HepG2細胞的凋亡、鐵死亡相關蛋白的表達；A HepG2細胞ROS含量；B HepG2細胞凋亡圖；C HepG2細胞SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白表達

表3 抑制miR-452-5p誘導HepG2細胞凋亡、鐵死亡

2.4 miR-452-5p靶向調控YTHDF2的表達 miR-452-5p組YTHDF2-WT細胞的熒光活性顯著低于miR-con組；與miR-con組相比，miR-452-5p組YTHDF2蛋白表達顯著降低，與anti-miR-con組相比，anti-miR-452-5p組YTHDF2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 miR-452-5p靶向調控YTHDF2;A miR-452-5p與YTHDF2的靶向序列；B HepG2細胞中YTHDF2蛋白表達

表4 雙熒光素酶報告實驗結果及miR-452-5p調控YTHDF2的表達

2.5 過表達YTHDF2調控HepG2細胞凋亡、鐵死亡 與pcDNA組比較，pcDNA-YTHDF2組HepG2細胞中YTHDF2蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率顯著升高，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 過表達YTHDF2對HepG2細胞凋亡、鐵死亡的影響；A HepG2細胞ROS的含量；B HepG2細胞的凋亡圖；C HepG2細胞中YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達

表5 過表達YTHDF2抑制HepG2細胞凋亡、鐵死亡

2.6 敲減YTHDF2部分逆轉anti-miR-452-5p對HepG2細胞凋亡、鐵死亡的作用 與anti-miR-452-5p+si-con組比較，anti-miR-452-5p+si-YTHDF2組HepG2細胞YTHDF2蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率降低，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見表6，圖5。

表6 敲減YTHDF2的anti-miR-452-5p處理HepG2細胞凋亡、鐵死亡情況

圖5 敲減YTHDF2對anti-miR-452-5p調控HepG2細胞凋亡、鐵死亡的影響;A ROS含量的熒光圖；B HepG2細胞凋亡圖；C HepG2細胞YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達

3 討論

miR-452-3p/5p參與人類多種癌癥的進展，如胃癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等[9,10]。雖有大量證據顯示miRNA參與癌癥的惡化進程的調控，但是其調控的機制十分復雜，至今仍在探索之中。Tang等[4]報道，miR-452-3p在肝癌樣本中的表達異常升高，并且過度表達miR-452-3p促進癌細胞的增殖、遷移，抑制凋亡，這與miR-452-3p直接靶向抑制CPEB3/EGFR信號通路的活性存在聯系。Yang等[11]在肝癌的研究中報道，circ-ABCB10在體內和體外均抑制肝癌的惡性進展，其機制與抑制miR-340-5p/miR-452-5p-NRP1/ABL2信號通路的活性相關，為肝癌的靶向治療提供新靶點。Zheng等[12]最新研究報道，miR-452-5p在肝癌中的表達顯著升高，并作為癌基因參與肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制為靶向COLEC10。這些研究說明miR-452-5p參與肝癌的惡化過程且作用機制多種多樣，但是其是否與肝癌細胞的鐵死亡存在聯系尚未可知。本研究檢測了正常肝細胞和肝細胞癌細胞中miR-452-5p的表達，結果與前人的研究結果相一致，即miR-452-5p在肝細胞癌細胞中高表達。抑制miR-452-5p抑制肝細胞癌細胞增殖，促進凋亡和鐵死亡以及鐵死亡相關基因ROS、SLC7A11、GPX4和FTH1的表達，這與前人關于miR-452-5p的研究結果[11,12]相吻合。進一步研究通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證了miR-452-5p靶向YTHDF2，也許YTHDF2可能與miR-452-5p調控肝細胞癌細胞凋亡和鐵死亡存在聯系。

m6A作為真核生物中最普遍的mRNA修飾之一，其在許多生物學過程中發揮作用，如mRNA穩定性、蛋白質翻譯、病毒感染和胚胎發育[13,14]。YTHDF2(YTH結構域家族成員2)是功能性m6A結合蛋白的明星基因，其主要調節mRNA的穩定性。YTDF2通過其C-末端YTH(YT521 B同源)結構域識別并結合mRNA 3’UTR位點，加速靶基因的降解[15]。據報道，YTHDF2在胰腺癌細胞中具有促進增殖和抑制遷移和侵入的雙重作用[16]。Hou等[17]發現，YTHDF2在肝癌組織中的表達顯著降低，這是由缺氧誘導因子-2α(HIF-2α)介導的，HIF-2α抑制劑或過表達YTHDF2可恢復YTHDF2的表達并抑制肝癌細胞的增殖和裸鼠體內腫瘤的生長，其機制與YTHDF2直接結合EGFR的 3’-UTR有關。但Shao等[18]報道，YTHDF2在肝細胞癌中高表達，與患者的不良預后、癌細胞浸潤緊密相關。本研究發現，YTHDF2在肝癌細胞中的表達顯著降低，與Hou等[17]的研究結果相一致，與Shao等[18]的研究結果相悖。過表達YTHDF2明顯促進HepG2細胞凋亡、鐵死亡，并且敲減YTHDF2還可部分逆轉抑制miR-452-5p對HepG2細胞凋亡、鐵死亡的促進作用。

綜上所述，抑制miR-452-5p促進肝細胞癌細胞凋亡、鐵死亡，產生這種作用的機制與直接靶向YTHDF2有關，為肝細胞癌的精準治療提供新靶點。