氯胺酮對腦膠質(zhì)瘤大鼠細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制

何元 王培 王君 段曉飛 張鐵峰

腦膠質(zhì)瘤具有治愈率低，發(fā)病率高的特點(diǎn)，其具有生長速度快，向周圍組織浸潤性生長的病理特點(diǎn)，手術(shù)后無法徹底根除腫瘤，仍有很大可能性復(fù)發(fā)，采用安全有效且不易復(fù)發(fā)的方式治療膠質(zhì)瘤極為重要[1,2]。氯胺酮作為苯環(huán)己哌啶的衍生物，是一種非競爭性的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體的拮抗劑，在周圍神經(jīng)組織中使用氯胺酮可提高麻醉效果，但是機(jī)體也可能因此出現(xiàn)幻覺[3]。近年也有研究表示，氯胺酮能有效抑制癌細(xì)胞的增殖，并且提升癌細(xì)胞化療敏感性[4]。該藥物也能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等凋亡。因此，本文分析腦膠質(zhì)瘤使用氯胺酮是否對大鼠細(xì)胞增殖、凋亡的產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取雄性SD大鼠49只，體重(200±20)g，3～4個月齡，動物實(shí)驗(yàn)許可證號：SCXK(魯)2012-0002，質(zhì)量合格證號：0015264。購自魯南制藥集團(tuán)股份有限公司。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠1周，進(jìn)行自由進(jìn)水，飲食。7 d后開始實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)嚴(yán)格按照動物實(shí)驗(yàn)的道德倫理要求進(jìn)行，我院倫理委員會同意、審批。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(上海艾研生物科技有限公司)、CCK8溶液(研載生物科技(上海)有限公司)、BindingBuffer200(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)液(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取指數(shù)生長期細(xì)胞，消化、分散均勻，濃度為1×1011/L，C6細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)于7℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。胰蛋白酶消化5 min后，棄去消化液。用PBS液沖洗3次形成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10/L的懸液用于接種，以培養(yǎng)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

1.3.2 分組及建模：將49只進(jìn)行建模，大鼠尾靜脈注射1%戊巴比妥鈉，將大鼠頭頂部毛發(fā)去除，橫向切開頭皮，露出前囪顱骨，前囪顱骨前1 mm，矢狀縫旁3 mm處鉆骨孔，抽取10 μl C6瘤株，經(jīng)骨孔進(jìn)針6 mm，后退1 mm，注射完畢后退針前留針5 min，骨孔使用骨蠟封閉，縫合切口。建模過程中意外死亡10只，最后建模成功39只。將這39只大鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量組、高劑量組，每組13只。

1.3.3 用藥方法：將建模成功的對照組、低劑量組、高劑量組，低劑量組大鼠腹腔注射濃度為5 mmol/L氯胺酮溶液進(jìn)行處理，高劑量大鼠腹腔注射濃度為10 mmol/L氯胺酮溶液進(jìn)行處理，對照組注射10 mmol/L的0.9%氯化納溶液。

1.3.4 樣本采集：用藥1周后以大量的戊巴比妥鈉處死大鼠，處死后取腦組織，全腦置于10%甲醛中放置1周，沿進(jìn)針點(diǎn)作冠狀切口，取腫瘤組織。

1.3.5 病理學(xué)觀察：取膠質(zhì)瘤組織，石蠟切片、染色，比較每組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)變化并做好記錄。

1.3.6 檢測方法：①酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞增殖：分別取4組腫瘤細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為4×105/L，細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔，在每個復(fù)孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，分別設(shè)置5個復(fù)孔，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)24、48及72 h后，加入10 μl的CCK8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，450 nm波長處測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。②流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：分別取4組腫瘤細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為1×106/L，細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔，取3 ml細(xì)胞懸液置于離心管中，4℃環(huán)境下1 000 r/min離心5 min，將上清液去除，經(jīng)過洗滌2次，加入BindingBuffer 200 μl搖勻，37℃室內(nèi)放置20 min，檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。③細(xì)胞遷移檢測：分別取4組腫瘤細(xì)胞密度調(diào)整為 105/ml，加入500 μl培養(yǎng)基，其上層加入100 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)2 d后，去除培養(yǎng)基，上層加入細(xì)胞樣本，下層加入DMEM培養(yǎng)基，設(shè)置3個復(fù)孔，37℃環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，進(jìn)行HE染色，隨機(jī)挑選5個視野，200倍下拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.3.7 JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)量檢測：取適量裂解液裂解大約30 min，之后將細(xì)胞收集，在4℃環(huán)境下1 500 r/min離心20 min后，取上清。試劑盒采用BCA試劑盒，測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液融合，采用電泳分離。取出PVDF膜，用50 g/L脫脂奶封閉，添加一抗后4℃環(huán)境下過夜培養(yǎng)，TBST清洗后添加二抗，37℃培養(yǎng)2 h，TBST洗膜，采用ECL試劑盒，內(nèi)參為GADPH。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察 對照組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織出現(xiàn)橢圓形，比正常周圍組織顏色深，邊界部分較清晰，向周圍腦組織浸潤性生長。低劑量組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織瘤體較大，切面可見出血和壞死。HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞排列密集，且異型性明顯，呈浸潤性生長，高劑量組大鼠腦膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞核分裂易見，腫瘤中心可見細(xì)胞壞死及細(xì)胞出血。正常組織與腫瘤之間可見腫瘤細(xì)胞呈浸潤性，出現(xiàn)明顯的分界線。見圖1。

對照組 低劑量組 高劑量組

2.2 細(xì)胞增殖活性比較 與對照組比較，12 h、24 h后，其他2組細(xì)胞增殖活性較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組細(xì)胞增殖活性低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 細(xì)胞增殖活性比較

2.3 細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與對照組比較，12 h、24 h后，低劑量組、高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.4 細(xì)胞遷移指數(shù)比較 與對照組比較，12 h、24 h后，其他2組細(xì)胞遷移指數(shù)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組細(xì)胞遷移指數(shù)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 細(xì)胞遷移指數(shù)比較

2.5 腫瘤組織JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)量比較 與對照組比較，低劑量組、高劑量組JAK2、p-STAT3、STAT3含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組JAK2、p-STAT3、STAT3含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,表4。

圖2 腫瘤組織JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)量比較

表4 腫瘤組織JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)量比較

3 討論

腦膠質(zhì)瘤多為惡性腫瘤，具有高發(fā)病、低治愈、易復(fù)發(fā)、高死亡率等特點(diǎn)，占在原發(fā)性腦腫瘤的一半以上，患者生存時間大多僅為13個月左右[5,6]。臨床治療上，常以手術(shù)輔以放射化療。但放射治療只能殺滅部分敏感細(xì)胞，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含有大量對放射治療不敏感的細(xì)胞，所以殘留的細(xì)胞復(fù)發(fā)的可能性巨大，不能根治。并且，血腦屏障會阻礙藥物進(jìn)入顱腦內(nèi)，導(dǎo)致進(jìn)入腦內(nèi)藥物濃度太低，使治療效果受到限制，患者同時接受化療藥物和放射治療還可能會損傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致的免疫功能下降[7,8]。

氯胺酮是一種短效麻醉藥物，可緩解各類疼痛，如果長期應(yīng)用會出現(xiàn)巨大的不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮具有阻斷興奮性氨基酸遞質(zhì)發(fā)揮的作用，并且還參與機(jī)體的抗氧化反應(yīng)[9,10]。另有數(shù)據(jù)顯示，氯胺酮還能干擾NMDA受體，導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙，并且NMDA受體被阻滯后，可能會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11,12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞處理后的12 h與24 h，使用高劑量氯胺酮的大鼠腫瘤細(xì)胞增殖活性，遷移指數(shù)都明顯降低，凋亡指數(shù)明顯升高，氯胺酮能有效抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞的主動死亡過程被稱作為細(xì)胞凋亡，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的形式有很多種，其中caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，主要是細(xì)胞通過死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑激活caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13,14]。Bcl-2家族凋亡調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞程序性壞死進(jìn)程，是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者，具有控制線粒體內(nèi)外膜的通透性的作用[15]。Bcl-2家族包括了促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白及Bim、Bid等蛋白[16]。

STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活的主要途徑為JAK2/STAT3信號通路。以往研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤中JAK、STAT都有異常表達(dá)，特別是STAT3激活后，可能是因?yàn)镾TAT3通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bax，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使惡性腫瘤發(fā)生，因此，抑制JAK2/STAT3，有可能會使腫瘤細(xì)胞生長減慢[17,18]。Bcl-2/Bax比值是影響細(xì)胞凋亡的主要因素，當(dāng)比值降低，細(xì)胞則會凋亡，而Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白[19,20]。Caspase3是caspase家族的代表，也是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。數(shù)據(jù)顯示，Caspase3能與Bcl-2共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。本文研究結(jié)果顯示，氯胺酮可降低JAK2/STAT3蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但目前并未準(zhǔn)確分析其中的機(jī)制，因此還需進(jìn)一步的研究，以明確其作用，為此病提供更好的診療價值。

綜上所述，高劑量的氯胺酮可明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖及促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，可能作用于JAK2/STAT3信號通路。因此氯胺酮可能成為未來治療腦膠質(zhì)瘤的一個新的有潛力的藥物，為治療腦膠質(zhì)瘤帶來新思路。