基于PI3K/AKT/GSK3β信號通路下調miR-208a對急性心肌梗死模型大鼠的干預作用

黃晶 雷玉華 華曉芳 周慧 朱賢林

急性心肌梗死是臨床中常見的一種心血管疾病，具有較高的致死率，在急性心肌梗死早期常常表現為冠狀動脈急性、持續性因缺血、缺氧導致心肌細胞大量死亡，是導致患者出現心肌重構，引發心力衰竭的主要原因[1,2]。PI3K/AKT/GSK3β可以促進心肌細胞增殖分裂，活化多種效應分子，在心肌細胞的存活方面發揮著關鍵作用，同時可以作為治療急性心肌梗死的關鍵分子靶點[3,4]。miRNA在多種心血管系統中均有表達，在心臟發育、心率失常、心肌重構、心肌細胞凋亡等病理變化中均有參與[5]。miR-208在心肌組織中顯示特異性表達，具有較高的保守性。本文旨在研究基于PI3K/AKT/GSK3β信號通路研究下調miR-208a對急性心肌梗死模型大鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本文選取健康、清潔級SD雄性大鼠40只，體重220～260 g，均由華北理工大學提供，合格證號:SYXK(冀)2020-007。鼠齡6～8周。大鼠均給予常規飼養，自由飲水，黑/白光照交替12 h，溫度為20～25℃，濕度為40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死模型建立：本文參考李曉琳等[6]的文獻建立模型：模型制備前12 h大鼠禁食，將大鼠麻醉后在胸前備皮，將大鼠頭、四肢固定，腹部朝上，常規消毒。在大鼠左側胸部第3、4肋間作橫切口，肌肉層分離后，將其胸腔撐開，確定心臟位置，心包膜撕開，心臟完全暴露后，找到左冠狀動脈前降支，在其2～3 mm 處使用6-0帶針線穿過前降支，結扎，將切口縫合。假手術組不做結扎，只穿線。發現大鼠左心室變白，心率減緩，Ⅱ導聯心電圖ST段抬高，表現為弓背向上型，說明模型建立成功。40只大鼠成功37只。

1.2.2 分組及干預：37只中有10只為假手術組，其余為模型組、空白組、miR-208a轉染組，每組9只。下調miR-208a通過敲低miR-208a實現，100 nmol/L轉染miRNA抑制劑轉染miR-208a，分為miR-208a轉染組，空白組使用100 nmol/L轉染miRNA抑制劑轉染無意義序列，均由中共廣州銳博公司提供。模型組、假手術組2組均給予等體積的生理研究干預。

1.2.3 miR-208a檢測：取大鼠尾部靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取得上層血清，放置-20℃凍箱內備用。采用實時熒光定量PCR檢測miR-208a表達：將采集到的100 μl血清加300 μl Trizol震蕩混勻靜置10 min，加80 μl氯仿再次震蕩混勻靜置5 min，離心后凝膠離心至管底，加100 μl DEPC水。將標本混合液15 000 r/min，離心處理15 min。提取上清至液轉移到含糖原EP管中，加等體積預冷異丙醇，混勻，-20℃靜置2 h。提取白色沉淀加1 ml的75%乙醇，混勻后充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500 g，離心處理5 min，摒棄上清液。加80 μl DEPC水對RNA沉淀進行溶解，-80℃保存。采用逆轉錄試劑盒(TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit)逆轉成cDNA，嚴格按照操作說明書進行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，以外源性cel-mir-39-3p作參照，采用2-ΔΔCT法對miR-208a表達水平分析。

1.2.4 心功能相關指標檢測：采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，通過超聲心動圖觀察大鼠左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)、左心室縮短分數(left ventricular shortening score，LVFS)。

1.2.5 心肌梗死面積、病理組織觀察：大鼠處死后，采集大鼠心肌組織，提取后采用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，將粘附在其表面的異物清除干凈，干凈紗布將表面水分吸干后制備切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，計算大鼠心肌梗死面積。之后切片經過二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，蘇木精染色5 min，流水沖洗后給予伊紅染色30 s，觀察。

1.2.6 指標檢測：ROS測定采用Fenton反應活性氧(ROS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)完成。酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)：提取標本包被液，對TGF-β 0.1 ml進行適當稀釋，進而加到聚苯乙烯反應板各孔中。加蓋 4℃ 24 h保存。次日使用洗滌液進行3次全方位洗滌，甩干；各孔內加不同稀釋倍數的待檢標本0.1 ml，同時增加陽性和陰性對照，置于43℃溫箱60 min，移去液體。同上述法則洗滌3次，甩干；各孔內加稀釋TGF-β 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min；各孔內加2 mol的TGF-β 0.05 ml，終止反應。試劑盒購自北京北方生物技術研究所，試驗操作嚴格根據說明書上的步驟進行。采用免疫印跡(Western blot)將標本提取液，利用1 000 r/min速率離心處理提取液，然后加入裂解液，進行反復凍融后以120 000 r/min再次離心處理，提取上清液，再利用酶標儀檢測PI3K、AKT、GSK3β蛋白濃度，保存后靜置。加入10%的分離膠，封閉，吸干水分，灌注5%的濃縮膠，凝固成功后置于電泳槽中將其固定，最后加入5 μl Marker和變性蛋白樣品，電泳30 min，將蛋白分離膠底后結束電泳，磚模成功后加入5%的脫脂奶粉進硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜中，封閉固定1 h，加入一抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶1 000)孵育，經過震蕩洗膜后加二抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶10 000)，孵育，再次震蕩洗膜，最后以GAPDH為內參，使用紅外熒光成像系統對結果給予分析。

2 結果

2.1 4組大鼠miR-208a表達比較 miR-208a轉染組miR-208a表達低于模型組、空白組，高于假手術組(P<0.05)；模型組、空白組miR-208a表達均高于假手術組(P<0.05)；模型組、空白組miR-208a表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠miR-208a表達比較

2.2 4組大鼠心功能相關指標比較 miR-208a轉染組LVEF、LVFS高于模型組、空白組，低于假手術組(P<0.05)；LVDd、LVDs低于模型組、空白組，高于假手術組(P<0.05)；模型組、空白組LVEF、LVFS低于假手術組，LVDd、LVDs高于假手術組(P<0.05)；空白組LVEF、LVFS高于模型組，LVDd、LVDs低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心功能相關指標比較

2.3 4組大鼠病理組織觀察 假手術組大鼠心肌細胞表現為桿狀、細長，橫紋肌表現正常，細胞排列整齊；模型組大鼠梗死區域較薄，心肌細胞明顯減少，細胞排列紊亂，細胞腫脹，血管有明顯的充血，有大量炎性細胞浸潤。空白組細胞排列、腫脹等方面明顯改善。miR-208a轉染組大鼠細胞排列恢復整齊，細胞腫脹、炎性浸潤消失。見圖1。

圖1 4組大鼠病理組織觀察(HE染色×200)

2.4 4組大鼠心肌梗死面積比較 miR-208a轉染組心肌梗死面積低于模型組、空白(P<0.05)；空白組心肌梗死面積低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心肌梗死面積比較

2.5 4組大鼠ROS、TGF-β水平比較 miR-208a轉染組ROS、TGF-β水平低于模型組、空白組，高于假手術組(P<0.05)；模型組、空白組ROS、TGF-β水平分別高于假手術組(P<0.05)；空白組ROS、TGF-β水平低于模型組(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠ROS、TGF-β水平比較

2.6 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關指標比較 miR-208a轉染組PI3K、AKT、GSK3β表達低于模型組、空白組，高于假手術組(P<0.05)；模型組、空白組PI3K、AKT、GSK3β表達高于假手術組(P<0.05)；空白組PI3K、AKT、GSK3β表達低于模型組(P<0.05)。見表5,圖2。

表5 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關指標比較

圖2 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關指標比較(WB圖)

3 討論

研究指出急性心肌梗死發病會導致機體中定居型巨噬細胞數量增加，脾臟會釋放大量的聚集型巨噬細胞、炎性細胞、中性粒細胞以及單核細胞等大量在梗死部位聚集，造成炎性反應，心肌損傷的速度不斷加快[7,8]。急性心肌梗死發病過程是心肌不斷壞死的過程，目前實驗研究主要采用冠狀動脈左前降支結扎術建立急性心肌梗死模型，主要是其病理變化與實際貼近[9]，使得實驗結果更加科學。

miR-208a通過調節肌球蛋白基因表達，參與肌肉生理、病理信號反應過程，具有心臟特異性，只在心臟中表達[10]。陳耽等[11]研究指出，miR-208a抑制劑通過下調β-MHC表達，能控制高血壓大鼠心功能障礙發展過程。在再灌注損傷大鼠中miR-208a表達較高，在缺血后處理大鼠中表達下降，β-MHC基因表達的高低與miR-208a表達呈正相關[12]。本文研究結果顯示，在急性心肌梗死模型大鼠中，miR-208a表達較高，miR-208a轉染組miR-208a表達降低，提示miR-208a轉染成功。經過miR-208a轉染干預，急性心肌梗死模型大鼠LVEF、LVFS升高，LVDd、LVDs降低，說明miR-208a轉染能改善大鼠心功能相關指標，促進大鼠心功能恢復。本文中miR-208a轉染能縮小急性心肌梗死模型大鼠心肌梗死面積，從而改善大鼠心肌病變的嚴重程度，大鼠心肌組織炎性細胞浸潤狀況也得到顯著的改善。

當心肌梗死發生時，因心肌細胞氧代謝障礙，線粒體功能失衡等影響，導致大量的ROS產生，因為蛋白質發生氧化損傷，引發心功能變化，在急性心肌梗死中伴有大量的肌鈣蛋白、肌動蛋白提升，是由于ROS損傷心肌細胞導致[13,14]。TGF-β參與心肌重構、心肌纖維化等過程，對心臟成纖維細胞遷移有明顯的誘導作用，將促纖維化程序激活[15,16]。本文研究結果顯示，miR-208a轉染能降低ROS、TGF-β水平，從而起到減輕大鼠心肌損傷、心肌纖維化的作用。

相關研究表明，PI3K/AKT/GSK3β通路會促進心肌組織的纖維化，其上調會損害心肌細胞[17-19]，其會參與急性心肌梗死的發病過程。本研究結果顯示，miR-208a轉染能明顯能下調PI3K、AKT、GSK3β水平，抑制PI3K/AKT/GSK3β通路，進而抑制心肌細胞凋亡，降低缺血灌注及缺血引發的心肌組織損傷，最終起到保護大鼠心肌細胞的作用。另外，PI3K/Akt/GSK3β通路被激活后，TGF-β、Hes1、HIF-1α等炎性因子會被進一步釋放，炎性反應加劇[20,21]。而miR-208a轉染在抑制PI3K/Akt/GSK3β通路后，也會減輕機體炎性反應，緩解心肌損傷。

綜上所述，下調miR-208a可以抑制PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白，進而抑制心肌細胞凋亡，緩解機體炎性反應，保護機體心肌細胞，最終減緩心肌損傷程度，同時也能改善急性心肌梗死模型大鼠心功能，減少心肌梗死面積，為臨床急性心肌梗死靶向治療提供依據。