基于生信學(xué)分析乳腺癌組織PD-1、CTLA4和LAG-3表達與預(yù)后的關(guān)系

孫婷婷 方文 熊偉 王偉 邵春燕

世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的國際腫瘤登記中心的報告數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增乳腺癌病例115萬，占全部女性腫瘤的23%；死亡病例41萬，占全部女性腫瘤的14%[1]。目前，腫瘤學(xué)領(lǐng)域正在強調(diào)癌癥免疫治療在癌癥治療中的有效性。值得注意的是，免疫檢查點分子，包括程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA4)和淋巴激活基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)，被認為是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控因子，這推動了免疫檢查點靶向治療策略的出現(xiàn)[2]，他們在自身的免疫保護中起著關(guān)鍵作用,并維持著自身免疫耐受。在免疫微環(huán)境中,這些免疫調(diào)節(jié)分子多數(shù)已被證實[3]。PD-1主要在活化的免疫細胞上表達，包括T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)，從而抑制過度的免疫反應(yīng)，保護正常細胞免受免疫攻擊。然而，腫瘤細胞利用PD-1/程序性死亡配體1(PDL1)來逃避宿主的免疫系統(tǒng)。PD-1通路因其在誘導(dǎo)T細胞的免疫檢查點反應(yīng)中的作用，導(dǎo)致腫瘤細胞能夠逃避免疫監(jiān)視，對常規(guī)化療高度不耐受，因此受到了相當(dāng)大的關(guān)注[4]。有學(xué)者證明了CTLA-4的負作用[5]，他的研究表明，CTLA-4與其配體的參與，消除了TCR后T細胞分泌和TCR激活后的T細胞增殖。CTLA-4和PD-1阻滯劑可以有效的提高多種癌癥類型的應(yīng)答和生存率[6]。LAG-3是一個潛在的癌癥免疫治療的靶點，因為它對T淋巴細胞的負調(diào)控作用，并與PD-1聯(lián)合介導(dǎo)一種細胞衰竭狀態(tài)的能力[7]。在許多自身免疫模型中，LAG-3的不足還會導(dǎo)致疾病的惡化。在許多人類患者腫瘤樣本中，LAG-3與PD-1的共表達與T淋巴細胞功能障礙狀態(tài)相關(guān)[8]。本次研究評估分析乳腺癌中免疫檢查點分子的表達水平、免疫細胞浸潤水平以及我們還研究了這些免疫檢查點分子的預(yù)后意義，為乳腺癌治療和預(yù)后找到一個新方向。

1 資料與方法

1.1 利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)分析PD-1、CTLA4和LAG-3在不同腫瘤類型中的表達差異 通過TIMER 2.0網(wǎng)站(http://timer.comp-genomics.org)[9]數(shù)據(jù)庫類型分別選擇“PD-1、CTLA4和LAG-3”“顯示在不同癌癥組織中的差異表達。

1.2 利用UALCAN數(shù)據(jù)分析PD-1、CTLA4和LAG-3在不同類型乳腺癌組織中的表達 使用UALCAN網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/)[10]首頁，數(shù)據(jù)庫類型選擇“breast invasive carcinoma”分別輸入基因名稱“PD-1、CTLA4和LAG-3”，分析不同類型乳腺癌組織中PD-1、CTLA4和LAG-3基因表達的變化。

1.3 利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)分析平臺對PD-1、CTLA4和LAG-3在乳腺癌組織中浸潤T細胞的表達分析 使用TIMER 2.0網(wǎng)站(http://timer.comp-genomics.org)首頁，對PD-1、CTLA4和LAG-3對來自TCGA數(shù)據(jù)中乳腺癌組織中浸潤T細胞的表達分析。

1.4 生存分析 使用PrognoScan數(shù)據(jù)庫(http://www.prognoscan.org/)[11]比較乳腺癌組織中PD-1、CTLA4和LAG-3高表達與低表達樣本的生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、CTLA4和LAG-3基因在乳腺癌組織中的表達及在不同分型乳腺癌中的表達 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中的PD-1、CTLA4和LAG-3的表達量均高于正常組織(P<0.01)，同時，我們發(fā)現(xiàn)在不同分型的乳腺癌中，PD-1、CTLA4和LAG-3的表達量在三陰乳腺癌中表達量均高于其他類型的乳腺癌。見表1～6。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中PD-1在正常對照組和乳腺癌組中的表達比較

表2 PD-1在乳腺癌分子分型亞組中的表達比較

表3 CTLA4在正常對照組和乳腺癌組中的表達比較

表4 CTLA4在乳腺癌分子分型亞組中的表達比較

表5 LAG3在正常對照組和乳腺癌組中的表達比較

表6 LAG3在乳腺癌分子分型亞組中的表達比較

2.2 免疫檢查點分子PD-1、CTLA4和LAG-3在不同腫瘤類型組織中的表達 由于3個免疫檢查點分子PD-1(PDCD1)、CTLA4和LAG-3與T淋巴細胞的衰竭和免疫逃逸相關(guān)，因此我們使用TIMER2.0從TCGA數(shù)據(jù)庫來研究這些分子在腫瘤和正常組織中的mRNA水平。本研究從 TCGA 數(shù)據(jù)庫中評估 PD-1、CTLA4和LAG-3基因在32種腫瘤類型中1 087個樣本中的表達水平，通過數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，PD-1在腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌癥、乳腺癌和宮頸癌中的表達相對較高，而CTLA4在許多癌癥中的表達水平較高，包括乳腺癌和肺癌。LAG-3在膀胱癌、腦癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病中的表達相對較高。PD-1、CTLA4和LAG-3在不同癌癥組織與癌旁組織的表達存在差異。

圖1 PD-1、CTLA4和LAG-3免疫浸潤水平

2.4 乳腺癌中PD-1、CTLA4和LAG-3高表達樣本與低表達樣本的Kapln-Meier生存曲線 PD-1高表達的患者生存時間明顯低于低表達的患者(Hr=2.94,P=0.002);CTLA4高表達的患者生存時間明顯低于低表達的患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Hr=0.89,P=0.011);LAG-3高表達的患者生存時間明顯高于低表達的患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Hr=0.33,P=0.003)。見圖2。

圖2 PD1、CTLA4和LAG3在乳腺癌組織中和癌旁組織中高表達和低表達樣本的生存曲線

3 討論

乳腺癌是一種可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答腫瘤疾病[12]。在乳腺癌中，腫瘤的發(fā)展過程與腫瘤免疫微環(huán)境的變化有一定關(guān)系，說明免疫治療也可能應(yīng)用于乳腺癌的治療并取得一定療效。

PD-1被認為參加了T細胞衰竭，并負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。PD-1表達于T細胞表面，不同類型腫瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細胞中均有PD-1的高表達，Mizuno等[13]研究報道，乳腺癌組織PD-1、PD-L1陽性表達均高于癌旁正常組織,這與其的相關(guān)研究相符。在正常情況下，PD-1與其配體結(jié)合后，能夠通過抑制自身的免疫應(yīng)答，預(yù)防發(fā)生自身免疫性疾病[14]。但許多研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細胞中PD-L1表達升高，可通過與淋巴細胞表面的PD-1相互作用，削弱機體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，促進腫瘤細胞免疫逃逸，繼而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。本研究中通過TCGA數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)分析，圖1所示，PD-1在乳腺癌中的表達顯著差異(P<0.01)，同時，在三陰乳腺癌中，PD-1的表達顯著高于其他分型的乳腺癌，K-M生存分析表示高表達PD-1的患者生存率明顯低于低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

CTLA-4主要通過與CD28受體競爭結(jié)合抗原提呈細胞(APCs)上的B7配體(B7-1/CD80和B7-2/CD86)。在T淋巴細胞的激活過程中，T淋巴細胞上的CD28受體與APCs上的B7配體結(jié)合，為T淋巴細胞提供第二激活信號。CTLA-4受體以較高的親和力與B7配體結(jié)合，因此，在CTLA4受體的存在下，缺乏第二種激活信號會導(dǎo)致T淋巴細胞的能量不足[16-18]。目前，阻斷 CTLA4與其配體結(jié)合能夠解 除 T細胞活性 受抑制狀態(tài)，重新激活 T細胞 的免疫 反應(yīng)從而引起抗腫瘤效應(yīng)。目前主要的CTLA-4抑制劑有 Ipilimumab、Tremelimumah等[19]。已經(jīng)開始應(yīng)用在治療乳腺癌的免疫治療中。通過本次的數(shù)據(jù)庫分析，CTLA-4在乳腺癌中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，同時在不同分型的乳腺癌中，也存在著不同的表達差異。K-M生存分析表示高表達CTLA-4的患者生存率明顯低于低表達患者(P<0.05)。目前很多研究表明，PD-1和CTLA-4的阻滯劑能提高癌癥患者的應(yīng)答率和中位生存時間，但也增加了不良事件的發(fā)生率，可能需要進一步的研究來減少不良事件的發(fā)生率和強度[20]。

抑制性免疫檢查點LAG-3抑制T細胞活化和細胞因子分泌，從而確保免疫穩(wěn)態(tài)。它對不同類型的淋巴細胞具有不同的抑制作用，與PD-1具有顯著的協(xié)同作用[21]。LAG-3是一個潛在的癌癥免疫治療靶點，因為它對T細胞的負調(diào)控作用及其與PD-1聯(lián)合介導(dǎo)細胞的衰竭[22]。LAG-3可能介導(dǎo)雙向信號進入相互作用的APC。MHCII類與表達LAG-3的Treg的結(jié)合已經(jīng)被證明可以抑制樹突細胞的激活，從而抑制它們的成熟[23]。通過數(shù)據(jù)庫分析，在乳腺癌中LAG-3的表達存在顯著差異(P<0.05)，同時在三陰乳腺癌中高度表達差異是值得被關(guān)注的，通過生存分析，在高水平表達LAG-3的乳腺癌患者中生存率明顯低于LAG-3低表達的患者。

綜上所述，本研究通過運用多種生物信息學(xué)的分析方法，對免疫檢查點PD-1、CTLA4和LAG-3在乳腺癌組織中的表達和免疫浸潤水平分析以及生存時間進行了綜合分析，我們認為在不同類型的乳癌癥組織中，免疫檢查點PD-1、CTLA4和LAG-3的表達水平不同，但在乳腺癌組織中的表達是具有顯著差異的，并影響乳腺癌患者的生存時間，說明這與疾病的預(yù)后是緊密相關(guān)的，PD-1、CTLA4和LAG-3可能會成為乳腺癌潛在的預(yù)后因子和治療靶點。同時在對免疫浸潤水平分析時發(fā)現(xiàn)，PD-1、CTLA4和LAG-3在不同的免疫細胞表達有顯著差異，這可能作為乳腺癌免疫治療新的研究方向。此外，本研究通過闡明免疫檢查點與疾病作用的關(guān)系，這將可能成為乳腺癌新的診療和預(yù)后評估方向。