不同小麥品種花青素含量多樣性及其合成基因表達分析

蘇培森，隋超，顏君，王晨，韓磊，王舒涵，劉曉倩，郭尚敬

(1.聊城大學農學與農業工程學院，山東 聊城 252000；2.山東農業大學信息與工程學院，山東 泰安 271018)

小麥(Triticum aestivumL.)在我國已經有五千多年的栽培歷史，種植區域廣泛，是目前我國僅次于水稻和玉米的第三大重要糧食作物，其制品是人類膳食的主要來源[1]。隨著人們生活水平的提高及對健康飲食的重視，對營養價值高、具有保健功能作物的需求日益增加[2－4]。小麥籽粒中胚乳、麩皮和胚芽分別占粒重的16.0%、81.2%、2.8%[5]。研究表明，增加全谷物的攝入可以有效預防心血管疾病、Ⅱ型糖尿病及癌癥等[6，7]。因此，培育特色功能性小麥品種對于改善人類膳食營養具有重要價值。

花青素(anthocyanins)屬于類黃酮次生代謝產物，是存在于高等植物體內的一種常見水溶性色素。目前已知的花青素有600多種，植物中比較常見的主要有6類，分別為飛燕草素、芍藥素、矮牽牛色素、矢車菊素、錦葵色素和天竺葵素[8，9]。花青素具有著色、抵御紫外線傷害、抗低溫等生物學功能[10]。花青素是植物花、葉片、果實、種子等組織中紅、藍、紫等顏色的主要顯色物，從而使植物呈現出不同的顏色，具有一定的觀賞價值[11－15]。花青素可保護光系統Ⅱ免受到達葉綠體的多余光子的影響，有助于降低己糖積累從而起到糖緩沖作用，并對光合作用的反饋調節具有積極影響[16]。花青素有助于清除脅迫下植物體內積累的活性氧，其含量與活性氧積累呈負相關，即花青素含量減少會降低植物的活性氧清除能力，導致組織中活性氧積累增多，使植物遭受更重的氧化損傷[17]；干旱和極端溫度變化會造成植物體內花青素沉著，且干旱時間延長會增加色素沉著[18]。此外，花青素可以清除細胞中的自由基[19]，在預防肥胖、心血管健康、抗炎、抗癌等方面發揮著重要作用[20－22]，如能抑制脂蛋白氧化和血小板聚集[23]，對抑制老年人動脈粥樣硬化有一定的作用[24]；對改善與年齡有關的神經退化和認知下降等有一些有益作用，幫助老年人改善記憶力[25]；可在一定程度上促進腫瘤細胞的凋亡，從而抑制癌細胞轉移[26－28]。花青素還能在一定程度上抑制視網膜的光化學損傷、放松睫狀平滑肌，起到保護視力的作用[29，30]。

不同類型的花青素主要在內質網中被查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、黃烷酮3－羥化酶(F3H)、黃酮3′－羥化酶(F3′H)、類黃酮3′，5′－羥化酶(F3′5′H)、二氫黃酮醇－4－還原酶(DFR)及無色花青素雙加氧酶/花青素合成酶(LDOX/ANS)等一系列酶催化合成，在經過一個或多個位點的甲基化、酰化或糖基化等修飾后，最終形成穩定的花青苷[31，32]，并由谷胱甘肽轉移酶(glutathione S－transferases，GST)或其他方式轉移至液泡中，形成各種不同的顏色[33]。目前編碼這些酶的很多基因已經在模式植物擬南芥中確定，包括CHS(tt4)、CHI(tt5)、F3H(tt6)、F3′H(tt7)、DFR(tt3)、LDOX/ANS(tt18，tt11，tt17，tds4)、GSTF12(tt14，tt19)與MATE(tt12)[34]。研究表明，擬南芥中AtDFR基因可以通過誘導甘藍型油菜中花色苷的積累，有效地調控鹽分和干旱脅迫耐受性[35]；擬南芥UFGT基因突變會導致不能合成色素，并且在突變體中過表達TaUFGT－4能使花青素合成恢復[36]；將藤茶的AgCHS1基因在煙草中過表達，可以提高煙草花瓣中的花青素含量[37]；在煙草中過表達HbF3′H1基因會導致其花瓣大量積累花青素，與非轉基因煙草相比顏色顯著加深[38]。

目前對花青素的研究已有很多，但關于不同小麥品種間花青素含量及相關基因表達的差異還有待探究。因此，本試驗通過比較不同小麥栽培品種幼苗期花青素含量的差異，并利用qRT－PCR對花青素代謝相關基因的表達量進行分析，以篩選富含花青素的小麥品種及影響花青素合成的關鍵基因，為后續培育功能性小麥提供種質資源和基因儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年9月至2022年3月在聊城大學農學與農業工程學院進行。供試58個小麥栽培品種為泡子麥、揚麥、蘇麥3號、小白麥、浙徐福75－3、介吉麥、Arz、紫優6號、周黑麥1號、山農紫麥1號、紫優5號、土麥、絲粉麥、淮麥33、揚麥158、老芒麥、融安小麥、九太石、和尚麥、遲熟小麥、火燒麥、淮麥、洋拉子、銅柱頭、紅麥、宜都小麥、富陽小麥、田晚、魯麥15、煙5158、莞7815－5－2－1、東莞小麥、有芒紅殼、黃塘麥、白慈麥、崇洋小麥、農林90、豬狼麥、白芒大籽、平頭麥、豫農211、鄭麥6號、生選6號、濟麥44、宛麥20、紅殼繭子頭、有芒紅殼、白麥、中青、Cp07－14、軟稈洋麥、封麥6號、KN199、05Z4－020、和陽春、濟麥22、海鹽種、泰農2413。挑選籽粒飽滿的種子，種植于營養土中培養3周，快速剪下小麥幼苗地上部分，迅速置于液氮中保存，用于花青素含量測定及RNA提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 花青素含量測定 參照Serrano等[39]的方法進行，具體步驟如下:稱取50 mg小麥葉片置于1.5 mL離心管中，在液氮中研成粉末；加入700μL酸性甲醇(甲醇與HCl體積比為99∶1)，于4℃過夜提取；然后于4℃、12 000 r/min離心1 min，取600 μL上清液于新的離心管中，加入1 mL三氯甲烷，再加400 μL蒸餾水，于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，利用分光光度儀(U－3000，HITACHI)分別在530、657 nm處測OD值。設3組生物學重復，每組重復測3次。計算公式:W＝(OD530－0.25OD657)/m[39]，其中，W為花青素相對含量，OD530、OD657分別為530、657 nm處的光密度值，m為樣品質量(g)。

利用Microsoft Excel 2016進行數據整理，采用Graphpad prism 9軟件進行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗(P＜0.05)。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 采用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)提取總RNA，然后用諾唯贊HiScript?ⅡQ RT Super-Mix for qPCR(＋gDNA wiper)反轉錄試劑盒反轉錄生成cDNA。去除基因組DNA體系(16 μL):4×gDNA wiper Mix 4 μL，100～300 ng/μL模板RNA 3 μL，加RNase－free ddH2O至16 μL；用移液器輕輕混勻，置于42℃2 min。隨后配制逆轉錄反應體系20 μL(包括第一步反應液16 μL，5×HiScriptⅡqRT SuperMix 4 μL)，用移液器輕輕混勻，然后50℃15 min進行逆轉錄反應，再85℃5 s使反應酶失活。

1.2.3 花青素合成相關基因的qRT－PCR檢測根據花青素合成的代謝通路，選取參與花青素合成的相關基因TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaCHI－5D、TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H和TaANS，以小麥18S rRNA為內參進行qRT－PCR分析。引物(表1)使用Primer Premier 5設計，由北京擎科生物科技有限公司合成。熒光定量PCR擴增使用諾唯贊熒光定量試劑盒(HiScriptⅢRT superMix)，反應體系為20 μL，包括cDNA模板2.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2×TB Green PremixTaqⅡ(TliRNaseHPlus)10 μL，ddH2O 7.2 μL。Real Time PCR反應程序為:95℃30 s；95℃10 s，55℃32 s，72℃1 min，40個循環。

表1 花青素合成相關基因的qRT－PCR引物

2 結果與分析

2.1 不同小麥栽培品種花青素含量多樣性分析

58個小麥栽培品種的花青素含量見表2，其中，浙徐福75－3的花青素含量最低，紅麥的花青素含量最高，是浙徐福75－3的6倍多；紫優6號、Arz、生選6號、宛麥20、紫優5號的花青素含量也較高；而泡子麥、蘇麥3號、淮麥、融安小麥、九太石、豬狼麥、泰農2413、揚麥、小白麥、田晚的花青素含量較低。經統計分析，有39個品種的花青素含量顯著高于蘇麥3號(P＜0.05)，有18個品種的花青素含量與蘇麥3號差異不顯著。

表2 不同小麥品種的花青素含量

2.2 花青素合成相關基因差異表達分析

為了進一步闡釋不同小麥品種花青素合成的差異機制，從58個小麥品種中選擇含不同水平花青素的10個品種進行花青素合成相關基因的表達分析，包括紫優6號、Arz、生選6號、紫優5號、濟麥44、農林90、封麥6號、小白麥、蘇麥3號和浙徐福75－3。

(1)調控花青素合成的轉錄因子TaMYB－7D1、TaMYC－2A1的表達量在不同小麥品種間差異明顯，均在生選6號中高表達，在蘇麥3號中不表達。另外，TaMYB－7D1在花青素含量較高的Arz、花青素含量低的浙徐福75－3、花青素含量中等的濟麥44中表達量也較高，TaMYC－2A1在濟麥44中的表達量也較高，但兩者在其他品種中的表達量均顯著降低(圖1)。

圖1 調控花青素合成的轉錄因子基因TaMYB－7D1、TaMYC－2A1在不同小麥品種中的表達情況

(2)花青素合成路徑上游相關基因TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT在不同小麥品種中的表達量也存在明顯差異，均在生選6號中表達量最高，在蘇麥3號中表達量最低(圖2)。其中，TaPAL－6D1－T2的表達量表現為生選6號＞農林90＞浙徐福75－3＞濟麥44＞小白麥＞Arz＞紫優5號＞紫優6號＞封麥6號＞蘇麥3號，在紫優6號、蘇麥3號和封麥6號中幾乎不表達，在浙徐福75－3、濟麥44、小白麥、Arz、紫優5號中表達水平相對較低。TaDFR－3B－T1的表達量表現為生選6號＞浙徐福75－3＞農林90＞Arz＞小白麥＞紫優6號＞紫優5號＞濟麥44＞封麥6號＞蘇麥3號，在紫優6號、紫優5號、濟麥44、封麥6號、蘇麥3號中幾乎不表達，在浙徐福75－3、農林90、Arz中表達水平相對較低。TaUFGT的表達量表現為生選6號＞農林90＞濟麥44＞紫優6號＞紫優5號＞Arz＞浙徐福75－3＞小白麥＞封麥6號＞蘇麥3號，在蘇麥3號中幾乎不表達，在紫優5號、Arz、浙徐福75－3、小白麥、封麥6中表達水平相對較低。

圖2 花青素合成相關基因TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT的相對表達量

(3)花青素合成路徑的關鍵酶基因TaCHI－5D、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H、TaANS的表達量也均以生選6號中最高，蘇麥3號或封麥6號中最低(圖3)。其中，TaCHI－5D在其他品種中的表達量較低，在小白麥、紫優5號、封麥6號、蘇麥3號中幾乎不表達；TaCHS在紫優6號中的表達水平也較高，僅略低于生選6號，在小白麥和蘇麥3號中幾乎不表達，在其他品種中的表達水平較低；TaF3′H在濟麥44、農林90中的表達量也較高，在小白麥、紫優6號、封麥6號中幾乎不表達，在其他品種中表達水平較低；TaF3′5′H在農林90、濟麥44中表達水平也較高，在封麥6號、小白麥、蘇麥3號中幾乎不表達，在其他品種中表達水平相對較低；TaANS在浙徐福75－3、Arz、紫優5號、濟麥44、農林90中的表達量相對較高，在小白麥、蘇麥3號、封麥6號中幾乎不表達。

圖3 花青素合成路徑相關基因的表達量分析

綜合可見，上述基因均在花青素含量較高的生選6號中高表達，且表達量明顯高于其他品種；均在花青素含量較低的蘇麥3號中表達量很低或不表達，且除TaF3′H和TaANS表達量略高于封麥6號外，均明顯低于其他品種。其余品種中，紫優6號的高表達基因是TaCHS；Arz、浙徐福75－3中TaMYB－7D1表達水平相對較高；紫優5號中TaCHS、TaF3′5′H、TaF3′H、TaANS表達量較高；花青素含量中等的品種濟麥44中TaMYC－2A1表達水平相對較高；TaF3′5′H、TaF3′H、TaUFGT的表達水平在花青素含量中等的農林90中相對較高。

3 討論與結論

花青素不僅是類黃酮化合物中的一種，也是對植物著色和果實顏色形成很重要的一種色素，植物各組織器官的著色情況與花青素等類黃酮物質的生物合成調控網絡密不可分。目前，對植物類黃酮合成途徑的研究已相當清楚。根據花青素生物合成途徑，可將調控花青素合成的基因分為上游結構基因、早期結構基因、后期結構基因和修飾基因。上游結構基因包括苯丙氨酸氨酰化酶基因(PAL)和4－香豆酸－CoA連接酶基因(4CL)；早期結構基因包括CHS、CHI、F3H、F3′H和F3′5′H；后期結構基因包括DFR和ANS；修飾基因包括葡萄糖基轉移酶基因(GT)、甲基化轉移酶基因(MT)和酰基化轉移酶基因(AT)[40－42]。但關于小麥花青素合成機制以及調控花青素合成相關基因功能驗證的研究還相對較少。

本研究對58個小麥栽培品種的測定分析表明，不同品種間花青素含量存在差異，紅麥、紫優6號、Arz、生選6號、宛麥20、紫優5號中的花青素含量較高，而浙徐福75－3、泡子麥、蘇麥3號、淮麥、融安小麥的含量較低。選用不同花青素含量等級的10個品種進一步進行花青素合成路徑相關基因(TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaCHI－5D、TaPAL－6D1－T2、TaDFR－3B－T1、TaUFGT、TaCHS、TaF3′H、TaF3′5′H和TaANS)的表達分析，發現各基因在不同小麥品種中的表達量差異明顯，均在花青素含量較高的生選6號中高表達，在花青素含量較低的蘇麥3號中表達量很低或不表達。此外，TaMYB－7D1和TaMYC－2A1表達水平在花青素含量中等的濟麥44中也較高，TaF3′5′H、TaF3′H和TaUFGT基因在中等花青素含量品種農林90和濟麥44中表達水平也較高；紫優6號的高表達基因是TaCHS；Arz、浙徐福75－3中TaMYB－7D1表達水平相對較高；紫優5號中TaCHS、TaF3′5′H、TaF3′H、TaANS表達量較高，其余基因也均有一定表達。推測TaMYB－7D1、TaMYC－2A1、TaF3′5′H、TaF3′H、TaUFGT、TaCHS和TaANS可能在小麥花青素合成中扮演著更為重要的角色，其在不同品種中表達模式的差異可能是引起花青素含量存在明顯差異的重要原因，這可為今后進一步探索調控小麥花青素含量的分子機制提供重要的基因資源和種質儲備。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因屬上游結構基因，在植物花青素合成過程中扮演著重要的角色。前期有報道指出，在擬南芥中，細胞分裂素(Cytokinin)能夠通過誘導PAL1、CHI、CHS和DFR等基因的表達從而促進花青苷的積累[43]。本研究發現TaPAL－6D1－T2在10個小麥品種中均表達，尤其在花青素含量高的小麥品種中表達水平較高。

CHS是黃酮類化合物合成途徑的入口，可將1分子的香豆酰－CoA和3分子的丙二酰－CoA合成黃色的查耳酮，然后CHI再將查耳酮異構化形成柚皮素，柚皮素在F3H的作用下形成二氫山奈酚，然后分別在F3′H和F3′5′H的催化下形成二氫槲皮素和二氫楊梅素[44，45]。F3′H和F3′5′H都屬于P450細胞色素家族，分別是負責為飛燕草素和矢車菊素形成提供底物的關鍵酶[46]。本研究結果顯示，TaCHS基因在生選6號中的表達量最高，在紫優6號中次之，均明顯高于在其他品種中的表達；TaCHI－5D基因在生選6號中特異性高表達，在其他品種中表達量較低或不表達；F3′H和F3′5′H基因在生選6號、農林90和濟麥44中的表達量相對較高，尤以生選6號中的表達量最高。表明這4個基因在不同品種小麥花青素合成過程中發揮著不同的作用，其具體的功能及調控機制仍需進一步研究。

DFR和ANS是花青素合成路徑中主要的后期結構基因。其中，DFR是花青素合成途徑后期的第一個關鍵酶，是一種還原酶，可催化二氫山奈酚、二氫槲皮素、二氫楊梅素分別形成無色不穩定的原天竺葵素苷元、原矢車菊素苷元和原飛燕草素苷元，然后ANS、GT、AT及MT再將無色的花青素苷元合成有色且穩定的花青素苷，從而使植物呈現不同的顏色[47，48]。此外，DFR還可借助NADPH的作用將二氫黃酮醇催化成原花青素苷元，為下一步有色花青素苷的形成提供物質基礎[48]，而且其對底物的特異性決定了一種植物積累哪種花青素[49]。ANS是植物花青素生物合成末期的關鍵酶，主要催化無色花色素向有色花色素轉變[50]。在煙草中過量表達McANS能夠使煙草花瓣花青素積累增加，花色加深[51]。本研究結果顯示TaDFR－3B－T1在不同花青素含量小麥品種中均表達，但表達量不同，在生選6號中的表達量顯著高于其他品種；TaANS在生選6號、Arz、紫優5號、浙徐福75－3、濟麥44和農林90等花青素含量較高的品種中表達量明顯高于其他品種。

此外，前人研究表明貴紫麥1號中GzMYB－7D1和GzMYC－2A1參與調控其花青素合成[52]。本研究也發現TaMYB－7D1和TaMYC－2A1在不同小麥品種中表達水平差異明顯，尤其在花青素含量較高的生選6號、浙徐福75－3和濟麥44中表達量較高。

綜上所述，本研究篩選到一些花青素含量較高的小麥栽培品種，并初步探索了調控花青素合成的相關基因在不同花青素含量小麥品種中的表達情況。這不僅可為功能性小麥品種選育提供優異的種質資源，也可為小麥花青素合成機制的深入探究提供理論基礎和基因儲備。