一種適于PCR的植物內生真菌DNA提取方法及應用

李瑞平宋瑩瑩李麗莉孫康文門興元尹淑艷

(1.山東農業大學植物保護學院，山東 泰安 271018；2.山東省農業科學院植物保護研究所，山東 濟南 250100)

植物內生真菌(plant endophytes)是指其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織和器官內部，但不使其宿主植物表現出明顯感染癥狀的一類真菌[1，2]。它們資源豐富、分布廣泛，自然界中幾乎每種植物都含有內生真菌，僅近十幾年就分離鑒定了超過5 000個種，隸屬于171個屬[2－4]。目前鑒定內生真菌的主要方法為形態學和ITS(internal transcribed spacer)間隔測序[1，4]。

ITS核苷酸序列分析的基礎為內生真菌DNA提取。傳統的DNA提取方法主要包含CTAB法[4－12]、SDS法[9，12－20]、尿 素 法[21，22]、氯 化 芐法[22－27]、Chelex－100法[23，28－31]等，上述方法提取的模板質量雖然很高，但操作步驟復雜、效率低下、價格昂貴，有些還涉及到大量有機溶劑的使用，增加了對試驗人員的健康危害和環境污染。ITS間隔測序僅需要進行一次簡單的約600 bp的PCR擴增，對模板的質量要求極低。因此，有必要開發一種快速、簡單、高效、安全的DNA提取方法，用于滿足內生真菌大規模分子檢測的需要。

堿裂解法最早用于大腸桿菌質粒DNA的提取，隨后由Wang等[32]成功用于植物DNA的快速提取。然而該方法在真菌DNA的快速提取中鮮見報道，僅限絲核菌屬(Rhizoctonia)和蟲草屬(Cordyceps)[33，34]。由于植物內生真菌資源豐富，且不同種類間存在細胞壁成分以及次生代謝物的差異，因此有必要評估堿裂解法在不同種屬真菌的應用效果。本研究在堿裂解法的基礎上，利用組織破碎儀快速研磨后高溫處理，篩選出合適的NaOH濃度，評估了樣本的存儲條件，進而優化了DNA提取流程，并成功將其應用于68個屬內生真菌快速鑒定。本試驗證實了堿裂解法能夠用于植物內生真菌PCR模板的快速制備，為進一步拓展該方法在整個真菌界的應用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共計773株，其中白僵菌為本實驗室保存菌株，用于提取條件優化測試；其余772株為2021年7月在山東省130個縣采集的健康玉米、大豆、棉花等植株葉片采用表面消毒培養法分離[35]、挑取尖端菌絲純化獲得[36]。

1.2 試劑與引物

NaOH、Tris等生化試劑購置于生工生物工程(上海)股份有限公司，研磨珠(3 mm)購置于濟南博拓斯生物科技有限公司，PCR試劑(AG12206)購置于艾科瑞生物工程有限公司。NaOH溶液先配制成1.000 mol/L母液，隨后用無菌水分別稀釋為0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mol/L(編號為N1～N8)。Tris50為0.05 mol/L的Tris·HCl(pH 8.0)，簡寫為T50，其他試劑均為分析純常用試劑。引物ITS1、ITS4、LR0R、LR3R、LR7、LR5序列來源于Vilgalys Lab(https://sites.duke.edu/vilgalyslab/rdna＿primers＿for＿fungi/，表1)，由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。

表1 擴增ITS間隔和細胞核編碼的核糖體大亞基rDNA(nLSU)引物序列

1.3 提取方法

(1)1.5 mL離心管中放入兩個3 mm研磨珠，隨后加入提取緩沖液NaOH 100 μL；(2)超凈工作臺中用牙簽挑取少量菌絲(或菌苔、或菌塊)于上述離心管中；(3)采用RETSCH MM400組織研磨儀于25 Hz破碎2 min，瞬時離心；(4)置于90℃金屬浴中3～5 min(時間過長需排氣)，瞬時離心；(5)加入300 μL的T50，即為制備的PCR模板，－20℃或室溫保存備用。

1.4 PCR反應

PCR反應體系(25 μL):ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(AG12206)12.5 μL，引物(0.3 μmol/L)0.75 μL，模板1 μL，用ddH2O補足至25 μL。反應在BioRAD MyCycler型PCR儀上進行，ITS擴增程序:94℃2 min；進行12個循環的Touchdown PCR，條件為98℃10 s，60℃(－0.5℃/Cycler)10 s，72℃10 s；98℃10 s，54.5℃10 s，72℃10 s，共34個循環；最后72℃2 min，10℃保存。nLSU(LROR/LR3R/LR5/LR7)擴增程序:94℃2 min；98℃10 s，49℃10 s，72℃30 s，共34個循環；72℃2 min，10℃保存。

1.5 檢測方法

采用1.2% TAE瓊脂糖電泳(6 V/cm，30 min)進行檢測，EB染色，UVP凝膠成像系統拍照。PCR產物委托青島蔚來生物科技有限公司進行Sanger測序。

2 結果與分析

2.1 不同緩沖液制備DNA溶液的狀態

以白僵菌為試材，采用11種提取緩沖液按照1.3進行DNA提取，其中樣本溶液狀態、固體懸浮物量以及懸浮物狀態觀察點為1.3中第(3)步驟瞬時離心前，而離心后沉淀狀態為第(4)步瞬時離心后。結果(表2)表明，N1和N2兩種緩沖液裂解菌體后呈現均一狀態，其他緩沖液裂解不徹底，特別是N5、N6、N7、N8、T50、TE、DDW裂解菌體后存在大量組織碎片。因此，N1和N2兩種緩沖液裂解菌體效果最好，本著節約成本考慮，后續測試選擇N2緩沖液。

表2 不同緩沖液制備DNA模板樣本的狀態

2.2 NaOH濃度對PCR擴增的影響

為了探索NaOH濃度對于PCR擴增的抑制程度，進而明確堿裂解樣本的稀釋倍數，不同濃度NaOH制備的DNA樣本不使用T50稀釋，直接進行ITS擴增。由圖1可知，0.250 mol/L(N3)及以上(N1、N2)的NaOH濃度可完全抑制PCR反應，0.125～0.008 mol/L(N4－N8)的NaOH對PCR擴增無影響。結合前述樣本的裂解程度及溶液狀態，選擇0.500 mol/L NaOH制備的樣本T50稀釋4倍(0.125 mol/L NaOH)作為PCR模板。

圖1 NaOH濃度對PCR擴增效果的抑制作用檢測

2.3 不同緩沖液制備模板對PCR擴增效果的影響

按照1.3方法制備樣本，其中T50、TE、DDW粗提樣本不稀釋直接使用，并取少量菌絲體直接PCR。由圖2可知，0.500～0.008 mol/L(N2～N8)的NaOH經T50稀釋后以及T50、TE、DDW粗提樣本均可產生有效擴增；1.000 mol/L(N1)的NaOH制備樣本無擴增產物；菌絲體直接PCR擴增條帶極其微弱。該結果進一步表明0.500 mol/L的NaOH粗提樣本稀釋后，可用于真菌快速PCR鑒定。

圖2 ITS1/ITS4引物對11種緩沖液制備樣本及菌絲體的PCR檢測

2.4 模板存儲溫度對PCR擴增的影響

為了明確制備樣本的保存時間和溫度對于PCR擴增的影響，將DNA樣本分別存放于－20℃和室溫(25℃)，14 d后再次進行PCR擴增。與新制備樣本(圖2)相比，－20℃存儲樣本對PCR擴增無明顯影響(圖3A)，室溫存放結果顯示N2～N7和TE擴增效果不變，而N8、T50以及DDW出現了彌散(圖3B)。

圖3 制備的DNA樣本在不同存儲溫度下的PCR擴增結果

2.5 優選方法

依據制備樣本的PCR擴增效果、存儲狀況以及樣本溶液的狀態，確立了內生真菌ITS檢測中模板DNA的快速制備流程:1.5 mL離心管中放入兩個3 mm研磨珠，隨后加入0.500 mol/L的NaOH提取緩沖液100 μL，在超凈工作臺中用牙簽挑取少量菌絲于上述離心管中，采用組織研磨儀于25 Hz破碎2 min，瞬時離心后90℃金屬浴中3～5 min，再次瞬時離心后加入300 μL的0.05 mol/L的Tris·HCl(pH 8.0)，即為制備的PCR模板，－20℃或室溫保存備用。

2.6 優選方法對68個屬真菌的分類鑒定。

應用優選方法對本實驗室保存的白僵菌以及分離于玉米、大豆、棉花、地瓜植株的772個菌株進行擴增測試，結果表明711個可產生有效擴增，62個無帶或擴增較弱，擴增成功率為91.98%。Sanger測序結果顯示706個為單峰，5個菌株測序圖為雙峰，序列經本地Blastn(NT)比對鑒定后分布于68屬199種，圖4展示了68個屬的擴增結果，圖5為其中一個樣本的Sanger測序峰圖。

圖4 優選方法對68個屬真菌的PCR鑒定

圖5 PCR產物的Sanger測序

2.7 核糖體大亞基引物擴增測試

為了明確ITS引物擴增失敗的62個樣本是否與模板制備有關，利用nLSU引物(LROR/LR5擴增條帶大小939 bp、LR3R/LR5擴增條帶大小327 bp、LR3R/LR7擴增條帶大小782 bp)再次進行PCR擴增。由圖6可知，3對引物均可產生清晰擴增，該結果進一步表明ITS擴增失敗并非樣本制備問題。

圖6 nLSU核糖體3對引物在ITS擴增失敗的8個隨機樣本中的擴增

3 討論與結論

堿裂解法已廣泛應用于植物DNA快速提取，該方法的最大優勢在于DNA樣本制備高效、經濟、環保[37]，然而用該方法提取真菌DNA鮮見報道。本研究改進了堿裂解法并對其在真菌DNA快速提取中的應用及適用范圍進行了詳細闡述，優化了提取流程，拓展了該方法在植物內生真菌PCR檢測中的范圍。

針對白僵菌的測試中，DNA樣本粗提液(不稀釋)和稀釋后PCR的結果均證明，DNA樣本溶液中NaOH的濃度大于等于0.250 mol/L時，可完全抑制PCR反應，而不高于0.125 mol/L可正常進行PCR擴增，這一結果與徐宗昌等[38]的一致，其原因可能為高濃度的NaOH(≥0.250 mol/L)pH值≥13.4(https://www.osgeo.cn/app/s1678)，該pH值超出了PCR緩沖液的緩沖容量，導致PCR無法進行。DNA溶液不稀釋直接進行PCR，低濃度的NaOH、T50、TE、DDW雖然無法徹底裂解白僵菌，但仍可以進行PCR擴增，其原因可能為高溫導致部分DNA的釋放，滿足了PCR擴增對模板的要求，這為某些種屬真菌的裂解產物不稀釋直接進行PCR擴增提供了條件支持。但是由于NaOH濃度較低，其適用范圍可能具有一定的限制，需要進行單獨測試。DNA樣本的存儲試驗表明，低濃度的NaOH、T50及DDW制備樣本在儲存過程中出現了部分降解現象，而高濃度的NaOH(N2－N7)和TE溶液擴增效果未發現彌散，其原因可能為高濃度的NaOH及微量的EDTA均可抑制核酸酶的活性。

3對nLSU引物PCR成功擴增，表明62個樣本的擴增失敗并非DNA樣本制備問題，而是由于ITS1/ITS4引物匹配率不高。其片段長度測試則顯示了該方法可進行1 000 bp以下的快速PCR檢測，完全可以滿足ITS間隔約600 bp測序的要求。

本研究利用0.500 mol/L的NaOH和0.05 mol/L的Tris·HCl(pH8.0)優化了內生真菌DNA快速提取方法，該方法簡便快捷、所需樣本極少、不需要液氮及手工研磨、不使用有機溶劑且室溫下可長期儲存，并成功應用于68個屬199個種的內生真菌鑒定，極大拓展了堿裂解法在內生真菌PCR分類鑒定中的適用種屬范圍，可滿足大規模快速真菌鑒定的需要。