不同產地牛蒡根下腳料成分比較及赤芝固態發酵菌質成分變化分析

趙雙枝宋國賓裘紀瑩張彥昊陳蕾蕾李熙文周慶新袁瑋楊金玉

(1.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2.山東省農業科學院農產品加工與營養研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業農村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100；3.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014)

牛蒡(Arctium lappaL.)是菊科牛蒡屬兩年生草本直根類植物，又名“蝙蝠刺”“蒡翁菜”“東洋牛鞭菜”等。牛蒡喜生長在光照強、土壤深厚疏松、氣候溫潤潮濕的地方[1，2]。我國大部分地區均有種植，栽培區域主要在山東、江蘇、浙江、湖北、安徽、甘肅等地區[3]。牛蒡富含菊糖、蛋白質、鈣等營養成分及多種維生素、17種氨基酸，有較高的藥用和食用價值[4，5]。牛蒡葉、子、根均可作藥用[6，7]。牛蒡葉具有抗炎、疏風散熱、抗病毒等作用[8，9]；牛蒡子具有抗炎、抗病毒、免疫調節活性等[10，11]；牛蒡根的主要功效包括降脂、調節胃腸功能及提高機體代謝率等[12，13]。

近年來，國外對我國牛蒡根的需求量逐漸增加，但在對外出口的牛蒡根中會產生約10 t/hm2的不合格產品，主要作為廢棄物處理[14]；同時，在我國牛蒡根精深加工過程中會產生大量的下腳料。為提高經濟價值、避免資源浪費與環境污染，牛蒡根下腳料的綜合利用與開發具有深遠意義。研究不同產地牛蒡根下腳料的化學成分組成，旨在篩選出適合赤芝發酵的培養基質，通過赤芝－牛蒡根下腳料雙向發酵體系的建立，提高發酵菌質某些營養成分、功效成分及風味，以期開發出功能性牛蒡靈芝茶等飲品，既可解決牛蒡下腳料廢棄、腐爛引起的資源浪費和環境污染問題，又可提高該資源經濟價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛蒡根下腳料分別從山東安丘、江蘇徐州、安徽亳州、山東蘭陵、甘肅隴南及山東青島城陽地區農戶手中采集，是牛蒡根加工過程中產生的破碎料、殘根、碎屑等廢棄物，經清洗、切碎后于65℃烘箱烘干備用。赤芝(Ganoderma lucidum)菌種CICC 50006由山東省農業科學院農產品加工與營養研究所食品微生物團隊分離、保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化和種子培養基 PDA培養基經121℃高壓滅菌30 min后制成試管斜面備用。無菌條件下剖取小塊母種(1 cm2)，移接到斜面活化培養基，27℃恒溫培養，待菌絲長滿斜面后置于4℃保存備用。種子培養基為20%土豆汁、3%麥麩、3%葡萄糖、0.2%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂，自然pH。

1.2.2 牛蒡根下腳料預處理及發酵 將牛蒡根下腳料水中浸泡2 h，利用脫水機脫水，水分含量控制在65%，按300 g/袋裝袋，121℃滅菌2 h。赤芝接種量為10%，發酵溫度為26℃，分別于培養第7、10、13、16、19天取樣，粉碎后測定營養和功效成分。

1.2.3 固態發酵基質的篩選 檢測安丘、徐州、亳州、蘭陵、隴南、城陽6個地區牛蒡根下腳料中氨基酸總量、蛋白質、類黃酮、總糖、還原糖、菊糖、總三萜酸、核苷、揮發性物質種類和含量以及抗氧化活性。綜合赤芝菌生物學特性及對主要營養物質的需求，篩選出最優的固態發酵基質。

1.2.4 營養成分和功能成分測定 蛋白質含量:將烘干后的樣品粉碎，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》(凱氏定氮法)。

氨基酸含量:將烘干、粉碎后的樣品進行鹽酸酸解，參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

多糖含量:精密稱取烘干、粉碎均勻樣品1 g于具塞試管中，加入25 mL純水，沸水浴提取2 h，冷卻過濾后殘渣用20 mL純水再提取1 h，合并濾液，定容至50 mL，充分搖勻。采用苯酚硫酸法，參照劉夕娟等[15]的試驗方法進行測定。

還原糖含量:采用DNS試劑法，參照劉夕娟等[15]的試驗方法進行測定。

菊糖含量:根據總糖和還原糖標準曲線分別計算樣品中兩者的含量，然后根據公式計算菊糖含量。菊糖含量＝總糖含量－還原糖含量。

總三萜酸含量:參照劉超[16]的方法進行測定。精密稱取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL齊墩果酸標準品溶液于8支具塞試管中，水浴加熱揮發掉溶劑；分別向每支試管中加5%香草醛－冰醋酸溶液0.3 μL、高氯酸1 mL，密封；70℃水浴恒溫加熱25 min，取出后立即冰水冷卻，加冰醋酸10 μL，搖勻，550 nm處測定吸光值，以吸光度(A)為縱坐標、齊墩果酸濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，其回歸方程為A＝0.8633C，R2＝0.9991。粉碎后的樣品于40℃烘箱烘8 h，精密稱取各樣品2.0 g，放入具塞三角瓶中，加乙醇40mL，超聲30 min，過濾，濾渣加入無水乙醇30 mL，超聲30 min，過濾，用乙醇沖洗濾渣數次，濾液定容于100 mL，待測。精密吸取各供試品溶液0.2 mL，重復3次，按照上述標準曲線步驟操作測定吸光值，根據標準曲線計算濃度(mg/g)。

核苷含量:參照王金艷等[17]的方法進行測定。精密稱取粉碎后均勻的樣品1 g于10 mL具塞試管中，加入10 mL蒸餾水，混勻后超聲(500W，40 kHz)提取1 h。將試管取出后冷卻至室溫，混勻，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液過0.45 μm微孔濾膜并轉移至樣品瓶中，進行HPLC分析，繪制核苷標準曲線，對發酵前后核苷含量進行測定。

色譜條件:色譜柱為Aglient HC－C18柱(4.6mm×250 mm，5 μm)。流動相(甲醇－水)梯度洗脫程序:0→20 min，甲醇5%，水95%；20→35 min，甲醇20%，水80%；35→36 min，甲醇5%，水95%；36→40 min，甲醇5%，水95%。紫外檢測器，波長259 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

1.2.5 揮發性物質種類和含量測定 參照屠玥之等[18]的方法進行測定。稱取各待測樣品2.00g左右于頂空瓶中，加入5 mL蒸餾水、5 μL四甲基二戊醇，混勻，于65℃條件下將65 μm PDMS/DVB纖維萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，拔出萃取頭插入GC－MS進樣口中，220℃脫附2 min，進行GC－MS分析，得到質譜圖，由ChromaTOF軟件系統完成質譜分析。化合物檢索譜庫:NIST譜庫。以各揮發性組分的峰面積占總面積之比表示組分相對含量。

色譜條件:DB－Wax毛細管柱(60 m×320 μm×0.15 μm)；進樣口溫度220℃；載氣:氦氣(純度＞99.999%)；流速1 mL/min；分流進樣。升溫程序:50℃保持3 min，以3℃/min升溫至120℃并保持3 min，以5℃/min升溫至250℃并保持10 min；總分析時間為62 min。質譜條件:離子源為EI；電離能量:－70 eV；質量掃描范圍:33～600 u；離子源溫度:200℃；傳輸線溫度:250℃。

1.3 數據統計與分析

使用SPSS 26.0的ANOVA法進行單因子方差分析，統計各處理組之間的差異性，試驗數據用平均值±標準誤表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同地區牛蒡根下腳料營養成分和功效成分測定結果

2.1.1 不同地區牛蒡根下腳料營養成分含量由表1可知，安丘地區牛蒡根下腳料中氨基酸總量最高，達104.0 g/kg，與亳州地區的差異不顯著，但顯著高于其它地區。安丘地區牛蒡根下腳料中蛋白質含量最高，達117.9 g/kg，顯著高于其它地區。安丘地區牛蒡根下腳料中總糖和菊糖含量最高，分別達0.72、0.66 g/g，與隴南地區的差異不顯著，但顯著高于其它地區。可見，不同地區的牛蒡根下腳料中營養成分含量存在較大差異。

表1 不同地區牛蒡根下腳料營養成分含量

由表2可知，亳州、隴南地區牛蒡根下腳料均未檢出胞苷，各地區均未檢出鳥苷、肌苷及腺苷，安丘地區牛蒡根下腳料尿苷、核苷總量最高，顯著高于其它地區。

表2 不同地區牛蒡根下腳料中核苷含量(μg/g)

2.1.2 不同地區牛蒡根下腳料功效成分含量由表3可知，安丘地區牛蒡根下腳料中類黃酮含量最高，達6.72 mg/g，顯著高于其它地區。青島城陽地區總三萜酸含量最高，與蘭陵地區差異不顯著，但顯著高于其它地區。

表3 不同地區牛蒡根下腳料功效成分含量 (mg/g)

2.1.3 不同地區牛蒡根下腳料中揮發性物質種類和含量 表4表明，安丘地區牛蒡根下腳料樣品中共檢測到揮發性物質108種，相對含量達78.47%，亳州和蘭陵樣品的總揮發性物質種類也較多，相對含量也較高。在揮發性物質中，醛類、氮雜環化合物、醇類、有機酸類化合物的相對含量普遍較高。安丘地區樣品中檢測到醛類化合物23種，相對含量26.35%；氮雜環化合物19種，相對含量12.76%；醇類化合物11種，相對含量7.31%；有機酸類化合物8種，相對含量10.28%；烯類化合物9種，相對含量5.57%。

表4 不同地區牛蒡根下腳料中揮發性成分種類及含量

綜上，安丘地區牛蒡根下腳料中氨基酸總量、蛋白質含量、類黃酮含量、總糖和菊糖含量、核苷總量等營養和功效成分以及揮發性物質的種類和相對含量均最高，故選擇安丘地區牛蒡根下腳料為原料制備固態發酵基質，開展下一步的發酵試驗。

2.2 未發酵樣品及發酵菌質營養成分、功效成分和揮發性成分組成及含量分析

2.2.1 發酵前后營養成分含量分析 如表5所示，與未發酵樣品相比，發酵菌質氨基酸總量顯著下降，蛋白質含量顯著上升，說明赤芝菌絲體利用牛蒡根下腳料中的營養物質轉化合成了菌體蛋白。發酵菌質中總糖、菊糖含量顯著降低，還原糖含量顯著升高，說明赤芝在發酵過程中能分解牛蒡根下腳料中的糖類，以滿足自身生長繁殖需要，并且進行生物轉化。

表5 牛蒡根下腳料發酵前后營養成分含量比較

如圖1所示，未發酵樣品中不含鳥苷、肌苷、腺苷，經過發酵合成了上述核苷。未發酵樣品胞苷、尿苷及核苷總量較低，發酵后顯著性增加(P＜0.05)，核苷總量達到2 637.14 μg/g。

圖1 牛蒡根下腳料赤芝發酵前后核苷含量

2.2.2 發酵前后功效成分含量分析 如圖2所示，與未發酵樣品相比，牛蒡根下腳料赤芝發酵菌質中總三萜酸含量顯著提高(P＜0.05)，其中發酵第13、16天含量最高，說明牛蒡根下腳料赤芝發酵過程中能夠產生三萜酸類化合物。發酵前樣品中類黃酮含量為6.72 mg/g，發酵后未檢測出。

圖2 牛蒡根下腳料發酵前后總三萜酸含量

2.2.3 發酵前后揮發性成分組成及含量分析由表6可以看出，發酵第16天菌質中總揮發性成分種類由未發酵樣品中的108種減少到73種，但總揮發性成分的相對含量由78.47%增加到162.21%，說明經過發酵可去除原料本身的某些揮發性成分，同時賦予其更濃郁的香味，尤其是醛類、酮類和氧雜環類化合物的相對含量大幅提高。

表6 未發酵樣品和發酵菌質中揮發性成分種類及其含量

3 討論

牛蒡根中含有類黃酮、三萜酸類、核苷等多種小分子功效成分[19]，還具有醇、烯、醛、酮、酚、烷烴、有機酸、酯、氮雜環及氧雜環等揮發性成分[20]。不同地區牛蒡根下腳料中蛋白質、氨基酸、總糖、還原糖和核苷的含量差異較大。時新剛等[21]報道，山東蘭陵地區每100 g鮮牛蒡根中含有2.1 g蛋白質。本試驗結果顯示，蘭陵地區牛蒡根下腳料中蛋白質含量為110.5 g/kg，這可能是由于牛蒡品種、干鮮程度不同造成的。何虎翼等[22]研究證實，不同品種牛蒡根的營養成分差異較大。牛蒡根中氨基酸含量較高，約占干重的28%，其中精氨酸含量最高[23]。胡喜蘭等[24]研究發現，新疆伊犁、石河子兩個地區牛蒡根(干料)的氨基酸總量基本相同，分別為112.0、123.9 g/kg，與本試驗中安丘地區樣品相近，這表明牛蒡根下腳料含有較高的氨基酸，具有較高的再利用價值。徐孝梁等[25]研究表明，牛蒡根中菊糖含量與年均溫和土壤有機質含量無明顯相關性，與年日照量存在正相關關系，與年降水量和年相對濕度存在負相關性。

赤芝作為木腐真菌，菌絲體活力較高，分解能力較強。牛蒡根下腳料經過赤芝發酵后，氨基酸總量顯著降低，可能是由于赤芝菌在生長過程中利用牛蒡根下腳料中的氨基酸成分，以滿足自身生長，同時轉化合成其它物質，從而造成了氨基酸總量的降低。高文庚等[26]對靈芝發酵粉基質進行優化，使氨基酸質量分數增加了7%，與本試驗結果有一定差異，可能是本試驗發酵過程中沒有外源營養物質添加的原因。有研究報道采用靈芝－牛蒡根發酵后，菌質蛋白質含量顯著升高[27]；采用靈芝－枇杷葉發酵后，菌質總蛋白平均增長率為43.60%[28]。這與本試驗結果一致，可能是因為發酵過程中赤芝菌絲體生長產生了新的菌體蛋白。在本試驗中，發酵后總糖和菊糖顯著降低，核苷總量顯著升高，且合成了新的腺苷，與張命龍等[27]的結論一致。發酵后還原糖含量升高，這可能是由于赤芝菌絲體分解總糖生成還原糖。表明牛蒡根下腳料經赤芝菌絲體發酵后營養成分發生了較大改變，體現了真菌發酵牛蒡根下腳料的雙向效果。

類黃酮化合物普遍存在于植物體內的生物合成途徑中，而且可產生極其豐富的次生代謝物[29]，因具有清除自由基、抑菌等多種功能而受到廣泛關注。在本試驗發酵菌質中未檢測出類黃酮物質，而未發酵樣品中類黃酮含量為6.72 mg/g，說明發酵后類黃酮含量顯著降低，這與前人的研究結果一致[28]，表明類黃酮物質可能在牛蒡根下腳料－赤芝發酵過程中被赤芝菌絲體代謝利用轉化為其它物質，今后需進一步探究其轉化機制。三萜酸類化合物廣泛存在，枇杷葉、茯苓、牛蒡根中都含有三萜酸成分，是赤芝的主要生理活性成分，具有明顯的免疫調節、抗炎、抗病毒等功能[30]。本試驗中，未發酵基質中總三萜酸含量極低，僅為0.09 mg/g，發酵第16天菌質中總三萜酸含量最高，為0.23 mg/g，這說明赤芝菌絲體可能通過生物轉化機制，利用牛蒡根下腳料中的營養物質、活性物質等合成三萜類化合物，也與前人研究結果[31]一致。

本試驗中，牛蒡根下腳料經過赤芝菌絲體發酵后揮發性物質種類減少，但總成分相對含量顯著提升。

4 結論

本研究中山東安丘地區牛蒡根下腳料的氨基酸、蛋白質、總糖、菊糖、核苷、類黃酮含量及揮發性物質種類和相對含量高于其它產區，適合作為赤芝發酵的固態基質。牛蒡根下腳料經過赤芝固態發酵，明顯提高了菌質的營養成分和功效成分含量，同時去除了難聞、刺鼻氣味，更好地呈現了愉悅的香味，為牛蒡根下腳料的綜合利用和功能性牛蒡靈芝茶飲品的開發提供了理論依據和技術支撐。