智利大麥2Hch、4Hch和5Hch染色體特異分子標記的建立

陳志偉劉靜嫻宮文萍韓冉李豪圣劉建軍賈舉慶劉成

(1.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801；2.山東省農業科學院作物研究所/小麥玉米國家工程研究中心/農業農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創新中心/濟南市小麥遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250100；3.山東農業大學農學院，山東 泰安 271018)

小麥(Triticum aestivumL.)是世界上種植面積最大的糧食作物，養活了世界上超過1/3的人口[1]。在我國，小麥是第二大糧食作物，產量約占糧食總產量的22%[2]。然而，在小麥遺傳改良過程中，由于長期的品種間雜交選育，育成的小麥品種的遺傳基礎越來越狹窄，對生物脅迫和非生物脅迫的抗性下降甚至喪失，制約著小麥產量的進一步提高[3]。野生近緣物種是小麥抗病抗逆育種的優異基因源，通過雜交將其優良性狀導入小麥，可以豐富小麥的遺傳基礎，對提高小麥育種水平具有重要意義[3，4]。

智利大麥(Hordeum chilense，2n＝2x＝14，HchHch)是一年生野生種，主要分布于南美洲的智利、阿根廷等地[5]，其基因組內含有抗白粉病、葉銹病、稈銹病、全蝕病和穎枯病等的抗病基因[6，7]及抗干旱脅迫和鹽脅迫等的抗逆基因[8，9]，是小麥育種優異基因的潛在來源[10]。蔣繼明等[11]將智利大麥與小麥雜交并進行染色體加倍獲得了小麥－智利大麥雙二倍體，通過與小麥回交自交獲得一批小麥－智利大麥附加系和代換系等珍貴材料，為后續智利大麥優異基因的定位與利用奠定了基礎。

近年來，分子標記輔助育種越來越被育種家們接受并應用。SCAR、SSR及KASP等[12]標記已被廣泛應用于追蹤和選擇目標基因以及前景選擇和背景選擇[13，14]，大大縮短了育種年限，降低了育種成本，提高了育種效率。研究表明，禾本科物種的基因序列有較高的保守性[15]，可以根據已測序物種的基因序列開發引物來建立未測序物種的分子標記[16，17]?；诖?，PLUG引物[18]和IT引物[19]應運而生，并被用于小麥背景下遠緣物種染色體分子標記開發[14]。本研究利用PLUG引物和IT引物對中國春－智利大麥雙二倍體及對照小麥中國春進行PCR擴增，篩選能擴增出多態性片段的引物，對一套中國春－智利大麥附加系進行擴增，定位相關多態性片段，進而對相應附加系與小麥雜交后代進行檢測，驗證標記可用性，從而為小麥背景中智利大麥染色質的追蹤提供新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥中國春(Chinese Spring，CS)由電子科技大學楊足君教授提供。中國春－智利大麥雙二倍體(CS－Hchamp)由英國約翰英納斯中心(John Innes Centre，JIC)的Reader S.M.教授提供。CS－智利大麥2HchS端體附加系(TA7587)、CS－智利大 麥4Hch附 加 系(TA7588)、5Hch附 加 系(TA7589)、6Hch附加系(TA7590)以及7Hch附加系(TA7591)由美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與基因資源中心(Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC)的Gill B.S.教授提供。濟麥22(JM22)、濟 麥23(JM23)、濟 麥262(JM262)、濟麥229(JM229)、濟麥38(JM38)和濟麥44(JM44)由山東省農業科學院作物研究所小麥遺傳育種團隊培育。CZW1—CZW96是CS－智利大麥2HchS端體附加系/CS的雜交F2后代，CZW97—CZW192是CS－智利大麥4Hch附加系/CS的雜交F2后代，CZW193—CZW288是CS－智利大麥5Hch附加系/CS的雜交F2后代。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取。稱取約100 mg的葉片放入2mL離心管(提前加入直徑2 mm的鋼珠)中，液氮中速凍3 min，然后用SCIENTZ－192組織研磨機在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，提取方法參見文獻[14]。

1.2.2 IT引物的PCR擴增及電泳 IT引物序列參見文獻[14]。PCR擴增程序:預變性94℃3min；變性94℃45 s，退火57℃45 s，延伸72℃1.5 min，共35個循環；充分延伸72℃10 min，4℃保存。706對IT引物由青島擎科天成生物技術有限公司合成，其中，染色體第二到第七同源群各175、120、89、140、71、111對。IT－PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳后，在紫外凝膠成像儀GDSGel Dol 2000下掃描照相。

1.2.3 PLUG引物的PCR擴增及電泳 PLUG引物序列參照文獻[14]，PCR擴增程序同IT引物。477對PLUG引物由青島擎科天成生物技術有限公司合成，其中，染色體第二到第七同源群各66、83、80、86、54、108對。未經過限制性內切酶酶切、經過限制性內切酶HaeⅢ或TaqⅠ酶切的PLUG－PCR產物分別在2%瓊脂糖凝膠中電泳后，在紫外凝膠成像儀GDS－Gel Dol 2000下掃描照相。

酶切體系(15 μL):酶0.2 μL，Buffer 1.5 μL，ddH2O 4.5 μL、PCR產物8.8 μL。酶切程序:TaqⅠ65℃2 h，HaeⅢ37℃2 h。

2 結果與分析

2.1 用于PCR穩定擴增的引物篩選

用477對PLUG引物對中國春和中國春－智利大麥雙二倍體的基因組DNA進行PCR擴增，結果發現，309對引物可以在供試材料中擴增出清晰明顯的DNA條帶，占總引物比約為64.8%；每對PLUG引物擴增出的條帶數量為1～7條，擴增出的片段大小為170～2 000 bp。上述309對引物中，能在供試材料中擴增出多態性條帶的，用一套小麥－智利大麥附加系進行擴增定位多態性標記所在染色體；不能直接擴增出多態性條帶的，利用限制性內切酶HaeⅢ和TaqⅠ對其PCR產物進行酶切，能酶切出多態性的，再用一套小麥－智利大麥附加系進行擴增后酶切定位多態性標記所在染色體。

用706對IT引物對中國春和中國春－智利大麥雙二倍體的基因組DNA進行PCR擴增，結果發現，670對引物可以在供試材料中擴增出清晰明顯的DNA條帶，占總引物比約為94.9%；每對IT引物擴增的條帶數為1～4條，擴增出的片段大小為100～2 000 bp。這670對引物中，能在供試材料中擴增出多態性條帶的，再用一套小麥－智利大麥附加系進行擴增定位多態性標記所在染色體。

2.2 智利大麥特異PLUG和IT標記的篩選

為了篩選智利大麥染色體特異性引物，我們利用中國春和中國春－智利大麥雙二倍體對上述引物進行進一步的篩選。結果發現，98對PLUG引物可在中國春與中國春－智利大麥雙二倍體間擴增或擴增/酶切出多態性條帶，其中，TNAC1061、TNAC1063和TNAC1066等引物的擴增結果如圖1A所示。37對IT引物可在中國春與中國春－智利大麥雙二倍體間擴增出多態性條帶，其中，CINAU1115、CINAU1116和CINAU1119等引物的擴增結果如圖1B所示。

圖1 PLUG引物和IT引物在中國春和中國春－智利大麥雙二倍體中的擴增結果

2.3 智利大麥染色體特異性PLUG和IT標記的建立

為了明確上述智利大麥特異性標記所在的染色體，我們利用這37對IT引物和98對PLUG引物對中國春、中國春－智利大麥附加系進行擴增，結 果 發 現，CINAU1093、CINAU1101和CINAU1121等17對IT引 物 以 及TNAC1240、TNAC1510和TNAC1326等38對PLUG引物能在小麥－智利大麥附加系中擴增出多態性片段，其中，有4對引物僅在智利大麥的2Hch染色體上擴增出特異性條帶，20對引物僅在4Hch染色體上擴增出多態性條帶，29對引物僅在5Hch染色體上擴增出多態性條帶，CINAU1217引物能同時在2Hch、4Hch和5Hch染色體上擴增出多態性條帶，CINAU1187能同時在4Hch和5Hch染色體上擴增出多態性條帶。因此，本研究共計獲得智利大麥染色體特異分子標記55個(表1)。引物CINAU1121和TNAC1510的擴增結果分別如圖2A、B所示。

圖2 引物CINAU1121和TNAC1510在供試材料中的擴增結果

表1(續)

表1(續)

2.4 智利大麥PLUG和IT標記的驗證

為了驗證建立的智利大麥染色體特異分子標記的可用性，利用篩選到的2Hch、4Hch和5Hch染色體特異引物(表1)分別對CS－智利大麥2HchS端體附加系/CS的雜交F2后代CZW1—CZW96、CS－智利大麥4Hch附加系/CS的雜交F2后代CZW97—CZW192以及CS－智利大麥5Hch附加系/CS的雜交F2后代CZW193—CZW288進行擴增，結果發現，上述引物均能在相應附加系/CS雜交后代中擴增出目標多態性條帶，說明這些標記可用于檢測小麥背景中的智利大麥染色質。其中，引物CINAU1121在CZW1—CZW24的擴增結果如圖3A所示，引物TNAC1615在CZW197—CZW220的擴增結果如圖3B所示。

3 討論與結論

智利大麥對小麥遺傳改良具有重要意義，因此多個智利大麥染色體特異標記得到建立。Hernández等[20]利用RAPD引物建立了11個可以用于鑒定小麥背景中智利大麥染色質的STS標記；Castillo等[21]利用EST－SSR引物建立了21個可用于對智利大麥多態性分析以及小麥標記輔助導入育種的EST－SSR標記。Said和Cabrera[22]利用SSR引物和STS引物建立了智利大麥8個SSR標記和4個STS標記；Mattera等[23]利用EST和COS引物建立了智利大麥特異性標記60個；陳志偉等[24]利用染色體第一同源群的PLUG引物和IT引物建立了智利大麥1HchL染色體的PLUG標記和IT標記各1個。但這對于智利大麥的染色體物理圖譜構建和基因精細定位還遠遠不夠。鑒于此，本研究開展了智利大麥染色體特異性分子標記的建立，共建立智利大麥染色體特異分子標記55個，包括38個PLUG標記和17個IT標記，為鑒定小麥背景中智利大麥染色體提供了新的檢測手段。

研究證明，PLUG引物和IT引物可以應用于小麥近緣物種染色體特異性標記的建立[3，14，17]。然而，利用這兩種引物建立智利大麥分子標記的報道卻比較少見。本研究利用上述兩種引物建立了智利大麥染色體特異PLUG標記38個和IT標記17個，標記獲得率分別為8.0%和2.4%，低于PLUG引物在帝國黑麥、多年生簇毛麥和無芒山羊草中的標記獲得率54.9%[25]、41.7%[26]和6.9%[27]，也低于IT引物在無芒山羊草以及簇毛麥中的標記獲得率21.5%[27]和51.8%[19]。利用PLUG和IT引物建立智利大麥染色體特異標記獲得率低的原因可能是智利大麥與小麥的親緣關系相對小麥與山羊草、黑麥和簇毛麥遠，上述猜測得到了來自物種5S RNA短間隔序列、5S RNA長間隔序列以及ITS序列分別對小麥族物種進行系統學分析結果的支持[28]。

智利大麥染色體上擁有小麥育種所需的優異基因[29－31]，其中，4Hch染色體上具有抗小麥葉枯病基因，4Hch和5Hch染色體上具有耐鹽基因。本研究建立的55個特異分子標記中50個被定位到4Hch或5Hch染色體上，其實用性也經過相應雜交分離群體進行了驗證，因此，可通過這些標記輔助從相應雜交分離群體后代材料中選擇鑒定耐鹽或抗葉枯病的小麥－智利大麥4Hch和5Hch染色體系。目前，筆者正在利用建立的智利大麥染色體特異分子標記結合熒光原位雜交以及耐鹽和葉枯病表型調查對小麥－智利大麥雜交后代材料CZW97—CZW288進行鑒定。