靈芝雜交育種及栽培技術

吳 芳，王小艷，王春暉，李文得，姜性堅

（湖南省食用菌研究所，湖南 長沙 410013）

靈芝屬擔子菌門（Basidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）物種。依據現代分類學研究，目前常見栽培的靈芝主要有赤芝（G.lingzhi）、亮蓋靈芝（G.lucidum）、中華靈芝（G.sinense）以及通過現代育種手段選育的多孢靈芝等[1-4]。隨著科學技術的日益革新，近幾十年來，靈芝種質資源、栽培技術及其在抗腫瘤、抗氧化、保肝、助眠等醫藥和保健領域的研究和應用廣受關注[5-9]。作為生產與應用最為廣泛的藥用菌之一，靈芝存在分類地位混亂、種質資源來源不清晰，同物異名等多種現象。目前已有戴玉成教授等學者相繼對靈芝的分類鑒定進行了較為全面系統的總結[10-11]，但是在靈芝種質資源評價、選育創新與利用等方面尚缺乏較為系統的研究。

單孢雜交育種能夠有效將不同來源親本的基因進行重組，而野生菌株與地方栽培品種的結合有利于篩選地方適栽的優良菌株[12-13]。這些是保障靈芝產業穩步健康發展的基礎。因此，筆者采用單孢雜交育種方式，將湖南省內較優的栽培品種與中華靈芝進行雜交，經生物學特性比較、出菇試驗及雜交菌株分子鑒定，選育出2株生長性狀穩定、生物轉化率高的雜交菌株，為豐富湖湘地區栽培靈芝種質資源、開發地方氣候適宜栽培品種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 親本1為湖南省內栽培較廣的商品菌株，具有菌絲生長快、朵大、菇形圓整、產量高但抗病蟲害能力較弱的特點。親本2的抗病蟲害能力強，但產量較低。上述菌株均保存于湖南省食用菌研究所。

1.1.2 供試培養基及配方 母種培養基為常規PDA培養基，原種及栽培種培養基配方為木屑40%、棉籽殼40%、玉米粉18%、紅糖1%、石膏粉1%，含水量60%。

1.2 試驗方法

1.2.1 單孢制備與雜交 單孢雜交參照于晶等[14]的方法，分別收集親本1和親本2的有性孢子，進行單孢分離培養，制備孢子單核菌絲體作為雜交親本。

1.2.2 單-雙核及雜交子鑒定 顯微觀察檢驗單孢菌絲及雜交菌株，觀察是否具有鎖狀聯合，將雜交菌株與親本置于同一培養皿培養觀察是否具有拮抗作用。

1.2.3 雜交子及親本分子鑒定 提取親本及獲得的雜交菌株的DNA，擴增ITS片段進行測序，比較分析序列堿基構成與變異，并采用UPGMA法進行系統聚類分析。

1.2.4 雜交子篩選 （1）初篩：采用PDA平板培養法，從獲得的39個雜交菌株中挑選15個與親本具有明顯拮抗作用的菌株，比較觀察其菌絲生長情況及培養時間。（2）復篩：挑選初篩結果中菌絲生長性狀較好的5個雜交菌株，通過栽培試驗進行復篩，根據當地栽培習慣，每個雜交菌株制袋100個，規格為17 cm×33 cm，每袋裝干料500 g，含水量約為60%，出菇條件溫度為28～32℃，空氣相對濕度85%～95%。每個菌株選取20個菌包，觀察記錄各菌株現蕾時間，子實體顏色、質地，菌肉厚度、產孢量等生物學性狀，并計算生物學效率。

2 結果與分析

2.1 雜交子獲得與初篩

由圖1可知，單孢培養分別獲得親本1單核菌絲10個，親本2單核菌絲12個，兩兩雜交形成120個組合，通過單孢選育共獲得雜交菌株39株，經顯微觀察均具有鎖狀聯合。由圖2可知，通過拮抗試驗挑選與親本存在明顯拮抗作用的15株編號為GH01～GH15，并進行菌絲生物學特性初篩。

圖1 親本與雜交子菌絲的顯微觀察結果

圖2 拮抗試驗結果

由表1可知，15個雜交菌株中GH01、GH03、GH07、GH09、GH10菌絲生長較快，活力長勢佳，且具有較低的感雜率，其他菌株存在感雜率偏高或菌絲較弱的現象。

表1 雜交子初篩菌絲生長與生物學特性

2.2 遺傳關系分析

提取15個雜交菌株的DNA，擴增獲得ITS序列，并采用UPGMA法進行系統聚類分析，結果如圖3所示，親本1與赤芝聚為一枝，親本2與中華靈芝（黑芝）聚為一枝，雜交菌株與2個親本形成獨立分枝，支持率均大于95%，可信度高，且雜交菌株與親本01號表現出相對較近的親緣關系。

圖3 基于ITS序列的系統發育分析（UPGMA法）

2.3 雜交子復篩

經菌絲生物學特性初篩，選擇GH01、GH03、GH07、GH09、GH10這5株性狀較優的菌株進行栽培試驗。結果表明，雜交菌株更多表現為親本1的形態性狀，如菌蓋顏色、產孢情況等，但雜交菌株菌柄較短；其中，GH07和GH09表現出較高的生物學轉化率和產孢量，且均略高于2個親本。總體來看，雜交菌株原基形成時間和菌蓋形成時間較早，具有一定的雜交優勢，但GH01、GH03菌株的生物轉化率低于其他雜交菌株，且出芝比例也較低，具體原因有待進一步探索研究。

2.4 主要栽培技術

2.4.1 菌袋制作與培養 采用17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋，裝料量500 g（干重）。栽培基質配方為雜木屑78%、麥麩20%、石膏粉1%、石灰1%，含水量60%，采用高壓蒸汽滅菌，121℃，2 h。無菌操作接種，于恒溫24℃、空氣相對濕度70%～75%、遮光培養。培菌期每天通風2次，每次30 min，保持環境清潔干凈，空氣清新。經24～26 d培養，菌絲長滿全袋后，再后熟培養7～10 d，至完全成熟。

2.4.2 開袋催蕾 當菌袋口開始吐黃水時，取下套環，揭開袋口。置于溫度26～28℃，空氣相對濕度80%～85%，光照100～200 lx環境條件下，培養6～7 d后，菌袋口開始現白色菇蕾，此時，應注意保溫保濕，并保持空氣清新，幼蕾逐漸長大，9～10 d后幼蕾頂部開始分化出黃褐色菌蓋，2～3 d后再分化出菌柄至芝體成形。

2.4.3 出菇期管理 出菇環境應保持溫度28～32℃，空氣相對濕度85%～95%，光照強度200～400 lx。每天定時覆蓋薄膜，通風透氣，保持空氣清新。當芝體長高至12 cm以上、菌蓋直徑≥8 cm時，芝體進入成熟期，此時，孢子便會從菌背面菌孔中彈射出來。為盡量減少孢子粉散失，宜用透氣紗布或尼龍網布蓋住，保持空氣通暢，以免影響孢子彈射，當孢子粉大量彈射時，空氣相對濕度降至80%左右，可采用地面灑水增濕，不能向芝體表面噴水，通氣不良或濕度過大會阻礙孢子彈射。當大量孢子聚集在蓋表面，形成一層1～2 cm厚的孢子粉時，可用干凈毛刷或吸塵機一次性收集。收集前3 d，停止施水降低濕度。收集后，應及時曬干，陰雨天應烘干至含水量≤11%，用塑料袋密封保存。

3 結論與討論

通過單孢雜交技術成功選育了赤芝與中華靈芝的雜交菌株，且通過篩選，獲得生物學特性與產量較優的GH07和GH09雜交菌株，這2個菌株具有菌柄較短、正品率高、生物轉化率高、產孢量高等特點，具有良好的市場應用與開發潛力，能夠為地方靈芝種質資源提供新的選擇。

表2 不同雜交菌株農藝性狀比較

何橋蘭[15]在赤芝與黑芝雜交的研究中，發現雜交后代在不同雜交菌株間，生物學轉化率和藥用成分等存在明顯差異，優勢并沒有集中體現在同一雜交菌株上。Liu等[16]用2個商業靈芝品種進行雜交選育的研究也表明，不同擔孢子萌發形成的單核菌絲，其菌絲生長，多糖、三萜等含量均具有明顯差異，且雜合子栽培形成的子實體后代在生物學轉化率、菌蓋顏色、形狀以及多糖、三萜等生物活性物質含量等方面均表現出非常顯著的差異。

另外，隨著分子生物學的不斷發展，研究手段日新月異，真菌全基因組測序以及各種組學研究得以實現，如Chen等[17]利用新一代測序技術和光學制圖技術對靈芝的基因組序列進行了研究，分析揭示了大量可能參與次生代謝與調控的基因或基因簇以及三萜和多糖類等生物活性物質的合成基因及調控表達基因，但其具體的代謝過程以及遺傳發育等機理尚不明確。

該研究中，通過對親本及雜交菌株進行ITS片段的擴增測序，能有效驗證其遺傳關系，但無法區分不同雜交菌株的遺傳多樣性，而在菌絲生長與復篩農藝性狀過程中不同雜交子表現出較為顯著的差異。因此，在靈芝選育栽培、藥理開發等研究領域，仍需進一步從交配型基因、雜交菌株特異性，或活性成分、生理生化與雜交機理等方面深入研究與探討[18-20]。