不同濃度血清對豬瘟兔化弱毒株感染滴度的影響

潘曉梅，王遵寶，候 鳳，周 濤，張慧敏，侯紅娟，毛麗萍，賀 筍

（天康生物制藥有限公司,新疆 烏魯木齊 830032）

豬瘟是由豬瘟病毒 （classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、高度接觸性、致死性疾病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須報(bào)告的動物疫病，在我國屬于一類動物傳染病，在世界許多國家、地區(qū)均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[1-6]。目前，豬瘟疫苗接種仍然是控制和預(yù)防豬瘟的主要手段。豬瘟病毒（LPC株）疫苗（中國C株）、細(xì)胞弱毒疫苗（日本GPE株和法國Thiwerval株）和中國臺灣的豬瘟病毒（LPC株）（兔體傳800代致弱,LPC株）仍被廣泛用于豬瘟的預(yù)防和控制[7]。豬瘟病毒可在多種細(xì)胞上增殖，包括ST細(xì)胞、PK-15細(xì)胞等，并且具有可以連續(xù)收毒的特點(diǎn)，但是豬瘟病毒一般不引起細(xì)胞病變[7-11]。

豬瘟疫苗的質(zhì)量是決定免疫效果，乃至豬瘟防控成效的關(guān)鍵因素。而疫苗中有效病毒含量是決定疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)。在病毒常規(guī)培養(yǎng)中，由于血清中存在一些非特異性抑制因子，能抑制某些病毒的生長及增殖，所以病毒維持液內(nèi)胎牛血清含量一般不超過2%，或不加血清[12-13]。目前，國內(nèi)外豬瘟病毒感染細(xì)胞的維持液常用的血清濃度為2%，有的可達(dá)3%～5%。目前，尚無不同濃度血清對豬瘟病毒感染力影響的比較研究。由于不同濃度血清對細(xì)胞的生長影響不同，可能會影響病毒感染力，因此本研究就不同濃度血清對豬瘟兔化弱毒株 （hog cholera lapinized virus，HCLV）在PK-15細(xì)胞上的感染力進(jìn)行比較，并探討豬瘟兔化弱毒感染PK-15細(xì)胞的適宜血清濃度。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和病毒株

PK-15細(xì)胞由天康生物制藥有限公司傳代與保存。豬瘟病毒HCLV株由天康生物制藥有限公司保管和供應(yīng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基和血清

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶TRYPSIN0.25%（1×）及胎牛血清購自Hyclone公司。

1.3 主要試劑

豬瘟陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗豬FITC標(biāo)記IgG購自Sigma公司；甲醛、磷酸鹽等為國產(chǎn)分析純。

1.4 儀器和設(shè)備

8道微量移液器、二氧化碳培養(yǎng)箱、核酸濃度測定儀和離心機(jī)購自 Thermo Fisher Scientific；熒光倒置顯微鏡購自Leica；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad；Tguide核酸自動提取儀和T-EASY自動化移液工作站購自TIANGEN；渦旋混勻器購自IKA。

1.5 引物信息

參考文獻(xiàn)[6]中豬瘟病毒特異性引物由Invitrogen公司合成熒光定量RT-PCR引物及探針，目的片段為121bp，探針 5′標(biāo)記 FAM 熒光報(bào)告基團(tuán)，3′標(biāo)記TAMRA淬滅基團(tuán)。

CSFV-F：5′-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-3′；

CSFV-R：5′-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3′；

CSFV-P：5′-CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA-3′。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 病毒液的制備。PK-15細(xì)胞長成單層后，將豬瘟病毒按照10%的體積比接種于生長良好的單層PK-15細(xì)胞，置于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中感作1h。倒去感作的液體，加入分別含有0%、2%、6%和10%血清濃度的維持液，每個(gè)血清濃度設(shè)1個(gè)平行對照，置37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。96h后第1次收獲（稱為一收）細(xì)胞方瓶中病毒液，再向培養(yǎng)瓶補(bǔ)充等體積含有不同血清濃度的維持液。如此反復(fù)可以再收獲病毒5次。將平行對照的兩個(gè)方瓶的病毒液混合后收獲，分裝保存于-70℃以下環(huán)境中備用。

1.6.2 病毒含量的測定。間接免疫熒光法（IFA）。在-70℃下取出待測的豬瘟病毒，用無血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和 10-77 個(gè)濃度稀釋。取培養(yǎng)好的PK-15細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，將上述的每個(gè)稀釋度病毒接種到96孔板中，設(shè)陰性對照，然后將96孔板置于37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出培養(yǎng)3d的細(xì)胞板，將病毒液倒入含有NaOH的廢棄桶中，經(jīng)PBST洗滌后加入丙酮固定，再經(jīng)PBST洗滌后加入稀釋好的陽性血清，37℃反應(yīng)1～2h。經(jīng)PBST洗滌后加入稀釋后的FITC標(biāo)記的兔抗豬的IgG，37℃反應(yīng) 1～2h。用 PBST洗滌后加入少量PBST，于倒置熒光顯微鏡下判讀豬瘟兔化弱毒株含量，以Reed-Muench方式計(jì)算病毒含量，以TCID50/mL表示。每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)。

熒光定量PCR法（qPCR）。以豬瘟病毒HCLV株核酸為模板，擴(kuò)增獲得目的基因，切膠回收，用pMD?19-T Simple Vector進(jìn)行載體連接，并將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，在含有Amp的LB培養(yǎng)基上篩選獲得含有目的基因的單個(gè)菌落。取菌液用QIAGEN? Plasmid Plus Midi Kit試劑盒提取質(zhì)粒，并用Quawell Q5000測定核酸濃度及純度；將質(zhì)粒核酸連續(xù)10倍梯度稀釋后作為熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。用自動核酸提取儀提取病毒樣品的核酸，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒的起始拷貝數(shù)。

反轉(zhuǎn)錄程序：反應(yīng)混合液 37 ℃反應(yīng)20min，85℃ 20s滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)液組分：反應(yīng)緩沖液2 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、Oligo dT 引物 0.5 μL、隨機(jī)引物2 μL、總RNA5 μL。

熒光定量PCR程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s；55.7℃退火30s，收集熒光信號；共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)液組分：熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5μL，上、下游引物及探針各0.5μL，cDNA模板2μL，雙蒸水9μL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的多因素方差分析比較在不同收獲時(shí)間、血清添加量條件下病毒毒價(jià)及病毒核酸含量的差異，從而確定收獲次數(shù)及血清濃度對病毒含量的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度血清培養(yǎng)條件下PK-15細(xì)胞的生長情況

收獲病毒后，將方瓶的細(xì)胞置倒置顯微鏡下觀察PK-15細(xì)胞的生長情況。隨著血清濃度的升高，PK-15細(xì)胞的密度越來越高。在0%的血清濃度條件下，細(xì)胞不能正常生長，大部分細(xì)胞脫落后死亡。在2%血清濃度條件下，細(xì)胞能形成致密單層，未見脫落死亡的細(xì)胞。在6%血清濃度條件下，細(xì)胞形成致密單層，部分細(xì)胞因密度過高形成少量的聚集體，未見脫落死亡細(xì)胞。在10%血清濃度條件下，細(xì)胞形成致密單層，大部分細(xì)胞因密度過高形成大量的聚集體，未見脫落死亡細(xì)胞（圖1）。

圖1 不同濃度血清培養(yǎng)條件下PK-15細(xì)胞的生長情況

2.2 不同濃度血清對病毒含量的影響

2.2.1 病毒毒價(jià)測定結(jié)果。用間接免疫熒光方法測定了豬瘟兔化弱毒株的病毒含量，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒免疫熒光均勻分布于細(xì)胞漿，呈綠色，陰性對照無熒光信號（圖2），陽性對照、陰性對照均成立。檢測結(jié)果如表1所示，2%、6%和10%血清濃度組的病毒毒價(jià)極顯著高于0%血清濃度組（P<0.01）；一收、二收和三收組2%血清組病毒毒價(jià)顯著低于6%、10%血清組（P<0.05）；同時(shí)，在二收和三收中6%、10%2個(gè)血清組的病毒毒價(jià)無顯著差異（P>0.05）；四收時(shí)2%、6%和10%血清組無顯著差異（P>0.05）；但在五收時(shí)，6%血清組的病毒毒價(jià)顯著高于2%和10%血清組（P>0.05）。說明血清對豬瘟兔化弱毒株感染PK-15細(xì)胞的能力有影響。

圖2 免疫熒光陰性和免疫熒光陽性圖

表1 不同濃度血清培養(yǎng)條件下病毒毒價(jià)測定結(jié)果（Log10TCID50/mL，Mean±SD）

2.2.2 熒光定量PCR測定結(jié)果。用qPCR法對不同濃度血清在同一收獲時(shí)間獲得的病毒含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，0%血清組病毒含量極顯著低于其他試驗(yàn)組（P<0.01），一收和二收組2%血清組病毒含量顯著低于6%、10%血清組（P<0.05）， 6%、10%2個(gè)血清組的病毒含量差異不顯著（P>0.05）；三收和四收組2%血清組病毒含量顯著低于10%血清組（P<0.05）；五收時(shí)2%、6%和10%血清組無顯著差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，血清對豬瘟兔化弱毒株感染PK-15細(xì)胞的能力影響較大，綜合成本考慮，6%血清濃度適合豬瘟兔化弱毒株在PK-15細(xì)胞上的擴(kuò)繁（表2）。

表2 不同濃度血清培養(yǎng)條件下病毒核酸含量測定結(jié)果（Log10Copies/mL，Mean±SD）

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

IFA方法（采用細(xì)胞培養(yǎng)法）是豬瘟病毒含量檢測的經(jīng)典方法，能真實(shí)反映種毒的感染能力即活病毒的含量。Real-time PCR方法具有快速便捷、高適應(yīng)性和可靠性、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好及特異性更高的優(yōu)勢，是實(shí)驗(yàn)室快速檢測的有效方法。以上兩種方法均能有效反應(yīng)病毒增殖情況，采用兩種方法對待測樣品進(jìn)行了檢測，并分析了兩種檢測方法的相關(guān)性。結(jié)果顯示，兩種檢測方法獲得的病毒含量呈顯著正相關(guān)（γ=0.9957），用一般線性模型（general linear model，GLM）擬合了病毒含量與病毒核酸含量的線性方程，見圖3。

圖3 病毒含量與病毒核酸載量的擬合曲線

3 討論

在動物疫苗生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本，降低生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或血清組分帶來干擾或差異的風(fēng)險(xiǎn)，提高生物制品的安全性，大多數(shù)采用無血清培養(yǎng)基[14-15]。但在使用過程中，有些病毒如口蹄疫病毒，有時(shí)會出現(xiàn)細(xì)胞生長良好，但病毒產(chǎn)量不高的問題。為了克服這一現(xiàn)象，許多廠家在病毒生產(chǎn)過程中，還是要加入1%～3%的低濃度血清[16]。血清中含有10多種氨基酸，還有促進(jìn)細(xì)胞生長以及貼壁的成分。但是，血清中存在一些非特異性抑制因子，能抑制某些病毒的生長及增殖，經(jīng)56℃ 30min不能被滅活。所以常規(guī)病毒維持液內(nèi)血清含量一般不超過2%，或不加血清[12-13],如培養(yǎng)水貂傳染性腸炎病毒以及雞傳染性法氏囊病病毒等不加血清。但對同步接毒的病毒細(xì)胞培養(yǎng)，如細(xì)小病毒的培養(yǎng)則必須加入適量血清[12，17]。

在生物制品中，使用無血清培養(yǎng)基，可提高生物制品的質(zhì)量、純度，方便產(chǎn)物的分離純化，減少由血清帶來的污染機(jī)會，減少過敏原，同時(shí)也降低了成本，便于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行代謝流分析，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)控，精準(zhǔn)投料。對于生產(chǎn)抗體的CHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，確實(shí)有優(yōu)勢[18-20]。但是對于多數(shù)病毒性疫苗來說，會出現(xiàn)病毒產(chǎn)量低的情況[16]，如本研究中的豬瘟兔化弱毒株。

本文的研究結(jié)果表明，與其他3種濃度的培養(yǎng)基相比，用含6%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行病毒感染培養(yǎng)，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，所測得的病毒含量相對較高，說明在含6%血清的培養(yǎng)基中，豬瘟兔化弱毒株感染力較強(qiáng)，更利于病毒的增殖，在感染相同時(shí)間后，此濃度培養(yǎng)條件下細(xì)胞所含病毒量更多，毒力更強(qiáng)。