梯棱羊肚菌補充2次外源營養的栽培技術*

羅祥英 ，李夢杰 ，曹 瑤 ，楊林雷 ，沈真輝 ，李 健 ，李文芝 ，陸青青 ，楊曉君 ，李榮春 **

（1.云南菌視界生物科技有限公司，云南 昆明 651708；2.昆明市[食用菌]企業工程技術中心，云南 昆明 651708）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）[1]。目前，羊肚菌屬共有78個系統發育學物種，分別由黃色羊肚菌支系、黑色羊肚菌支系和變紅羊肚菌支系3個類群構成；其中，黑色羊肚菌支系中的9個物種以及1個變紅羊肚菌物種已實現了人工栽培[2-3]。

1982年Ower[4]在人工控制條件下成功栽培出羊肚菌，這是羊肚菌人工栽培歷史上的一項重大成果，對羊肚菌產業發展產生了深遠影響。此后，國內許多學者也紛紛展開了羊肚菌的研究，自此羊肚菌栽培研究進入了快速發展期。2005年美國DNP（Diversified Natural Products）公司進行羊肚菌商業化室內栽培，但于2008年停產[5]。2000年～2003年，四川省林業科學院研究團隊將外源營養袋添加技術應用到羊肚菌的大田栽培，并取得成功，有效推動了我國羊肚菌商業化栽培的發展[6]。2012年開始，我國步入羊肚菌大田商業化栽培時代，到2020年，栽培面積從200 hm2增至1.4萬公頃～1.5萬公頃，我國成為了羊肚菌生產和出口第一大國[7-8]。隨著營養袋應用技術越來越成熟，羊肚菌大田栽培技術越來越完善，羊肚菌的產量和穩定性較之前大幅度提高。

然而，在目前的規模化栽培過程中仍然存在很多問題，如大面積絕收、低產、產量不穩定等。造成這些問題的原因主要是基礎科學研究滯后，栽培品種、栽培技術單一，對羊肚菌的營養特性、生活史、生態適應性方面沒有完全掌握，對外源營養袋的作用機理不清楚等[5，9-10]。因此，目前除了不斷加強基礎研究，選育高產、適應性強、穩定性好的品種以外，還應通過探索新的栽培技術來推動羊肚菌產業穩健、快速發展。外源營養袋的應用是羊肚菌栽培技術中最重要的組成部分，也是羊肚菌大田商業化栽培成功的關鍵技術，但目前對其作用機理尚不清楚，栽培技術難以提升。

盡管已經有一些學者探索了新的栽培技術，但著重論證技術的可行性，并沒有深入研究新技術對產量的影響[11-12]。前期通過15N同位素示蹤技術，研究了羊肚菌人工栽培過程中外源氮素營養的運輸機制，證明了外源營養中的氮素營養能夠通過土壤中的菌絲網絡，有效運輸到羊肚菌子實體中供其生長發育；同時，闡明了營養袋的時（擺放時間）空（有效距離）有效性問題[13]。在此基礎上，此次試驗通過同位素示蹤技術跟蹤第2次外源營養的運輸，探明補充第2次外源營養對產量的影響，深入探索羊肚菌補充2次外源營養的栽培技術，為羊肚菌產業發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和同位素

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）菌株JSJM15，由云南菌視界生物科技有限公司提供。15N-銨態硝酸銨，購自上海化工研究院。

1.2 培養基配方

母種培養基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂粉18 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH為6.0。

原種培養料：小麥70%、谷殼15%、麥麩5%、土壤8%、輕質碳酸鈣1%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.5%，含水量為45%。

栽培種培養料：麥粒56%、木屑12%、谷殼14%、土壤15%、蔗糖1%、輕質碳酸鈣1%、磷酸二氫鉀1%，含水量為45%。

營養袋：麥粒46%、木屑17%、谷殼18%、土壤18%、輕質碳酸鈣1%，含水量為45%。

1.3 羊肚菌栽培管理

試驗在云南菌視界生物科技有限公司基地進行，播種時間為2020年11月10日，從播種到采收周期為90 d。

原種和栽培種的制作參照參考文獻[14]的方法。

清除土壤上的雜物，用石灰調土壤pH至6～7[15]。播種前先挖出寬10 cm、深5 cm的播種溝，再進行土壤預濕。將準備好的栽培種揉碎，以每平方米500 g的播種量，將菌種均勻撒在播種溝內，立即覆蓋土壤，覆土厚度為3 cm～5 cm。播種10天后擺放營養袋。

菌絲培養階段，保持土壤含水量為25%～30%，空氣濕度為60%～75%；原基誘導階段將土壤含水量增加至30%～40%；幼菇生長發育階段將土壤含水量降低至25%～30%，空氣濕度為80%～95%。

1.4 同位素示蹤技術

氮素營養是羊肚菌生長發育的主要營養元素之一，研究證明，以硝酸銨為氮源時羊肚菌菌絲生長較好[16-18]。因此，試驗采用15N-銨態硝酸銨同位素示蹤技術，研究外源營養的運輸。羊肚菌栽培管理方法同1.3所述。試驗中外源營養補充及15N同位素標記情況詳見圖1。

圖1 外源營養補充及15N同位素標記示意圖Fig.1 Schematic diagram of the supplement exogenous nutrition and15N isotope labeling

如圖1所示，以只補充1次外源營養作為對照組（編號：EGCK），在播種后第10天開始補充1次外源營養，在外源營養中添加0.2 g·mL-1的15N-銨態硝酸銨溶液500 μL，并做好標記；以添加等量無菌水為對照組的空白對照（編號：CK1）。試驗組處理為：在播種后第10天開始補充第1次外源營養，第1次外源營養袋內不添加15N-銨態硝酸銨溶液，營養袋擺放30 d后撤去第1次外源營養，同時分別在撤去第1次外源營養的當天（即播種后第40天，圖1中時間記為0，編號EG1）、第10天（即播種后第50天，編號EG2）、第20天（即播種后第60天，編號EG3）補充新的外源營養（第2次外源營養），分別在第2次外源營養中添加0.2 g·mL-1的15N-銨態硝酸銨溶液500 μL，并做好標記；以添加等量無菌水為試驗組的空白對照（編號：CK2）。每個處理均設置3個重復。

待羊肚菌菌蓋表面蜂窩狀凹陷充分伸展時即可開始采收，分別取距離營養袋邊緣0～10 cm的新鮮子實體為樣品，每個樣品1.5 g（含菌蓋和菌柄各0.75 g），重復取樣10次。將樣品混合、烘干、粉碎后送上海化工研究院檢測15N豐度，具體方法參照國家標準《穩定性同位素15N無機標記化合物》（GB/T 20622-2006）[19]。

1.5 補充2次外源營養對羊肚菌產量的影響

對照組（編號：EGCK）：在播種后第10天開始補充1次外源營養，每個營養袋濕質量為430 g，每平方米補充6袋，擺放至第30天時撤去外源營養。試驗組：播種后第10天開始補充第1次外源營養，擺放至第30天撤去第1次外源營養；同時分別在撤去第1次外源營養的當天（即播種后第40天，編號EG1）、第10天（即播種后第50天，編號EG2）、第20天（即播種后第60天，編號EG3）補充新的外源營養。第2次外源營養采用350 mL廣口瓶為容器，營養料濕質量為200 g/瓶，每平方米補充6瓶。每個處理均設置3個重復。羊肚菌栽培管理方法同1.3所述。以各個處理的原基發生時間、原基數量、幼菇成活率（2 cm以上幼菇生長發育為成熟菇的比例）、產量等為指標進行觀測和統計，綜合評價羊肚菌補充2次外源營養的栽培技術。

測量統計方法：播種后每天觀察羊肚菌生長發育過程，以第1次發現原基為其原基發生時間；在原基發生后第5天統計原基數量。

2 結果與分析

2.1 外源營養的物質運輸

待羊肚菌子實體成熟后，分別取距離營養袋邊緣0～10 cm的子實體為樣品，測定其15N豐度。不同處理下子實體中15N的豐度值詳見圖2。

圖2 不同處理下成熟子實體中15N的豐度Fig.2 The15N abundance in mature fruit bodies under different treatments

如圖2所示，對照組EGCK（0.815%）羊肚菌成熟子實體中15N的豐度值顯著高于空白對照CKI（0.369%）。試驗組EG1、EG2、EG3成熟子實體中15N的豐度值依次為1.330%、0.865%、0.386%，均高于空白對照CK2（0.373%）；其中，EG1子實體中15N的豐度極顯著高于空白對照CK2，EG2子實體中15N的豐度顯著高于空白對照CK2。結果表明，2次補充的外源營養中的氮素營養均通過土壤中的菌絲網絡吸收、運輸到羊肚菌子實體中；在本試驗條件下，在撤去第1次外源營養后10天內（此時處于菌絲階段和原基階段）補充第2次外源營養較佳。

2.2 補充第2次外源營養對羊肚菌產量的影響

分別在第1次營養袋撤離后的當天（EG1，菌絲階段）、第10天（EG2，原基階段）以及第20天（EG3，幼菇階段）補充第2次外源營養。不同處理原基發生時間、數量、幼菇成活率及產量情況詳見表1、圖3和圖4。

表1 不同處理中梯棱羊肚菌的生長情況Tab.1 The growth of Morchella importuna in different treatments

如表1、圖3和圖4所示，不同處理下原基發生時間均為40 d～50 d，與對照組EGCK相比差異不顯著；原基數量與對照組EGCK之間差異不顯著。試驗組EG1、EG2、EG3幼菇成活率依次為33.33%、21.11%、18.89%，均高于對照組EGCK（17.78%）；平均產量依次為 835 g·m-2、530 g·m-2、474 g·m-2，均高于對照組EGCK（446 g·m-2）。其中處理EG1的平均產量極顯著高于對照EGCK；處理EG2的平均產量顯著高于對照EGCK；處理EG3的產量與對照差異不顯著。在出菇階段，處理EG1及EG2羊肚菌成熟子實體的密度顯著大于對照組EGCK。

圖3 不同處理下梯棱羊肚菌的平均產量Fig.3 Average yield of Morchella importuna under different treatments

圖4 不同處理下梯棱羊肚菌的出菇情況圖Fig.4 The figure of Morchella importuna.fruiting under different treatments

綜上所述，在本試驗條件下，梯棱羊肚菌播種后第40天～第50天（此時處于菌絲階段和原基發生階段）補充第2次外源營養效果最佳，其外源營養中的氮素營養物質能夠有效運輸到子實體中，并顯著提高產量。

3 結論與討論

羊肚菌是目前人工栽培食用菌中較特殊的一類大型真菌，也是為數不多的成功實現商業化栽培的子囊菌之一。羊肚菌為兼性（腐生和菌根）真菌，各品種在不同生境下經歷著不同的演化過程，一些種類具有確定的菌根型生態類型，而另一些種類又具有完整的腐生型生態類型[20-22]。隨著羊肚菌產業的不斷發展，理論基礎研究的進一步深入，對羊肚菌的生活史逐漸明晰。杜習慧等[23]認為羊肚菌有性生殖模式以異宗配合為主，還包括了假同宗配合和同宗配合；劉偉等[24-25]認為梯棱羊肚菌有“同宗結合”現象，又通過出菇試驗和交配型基因分析證明梯棱羊肚菌為異宗結合真菌；賀新生等[26]指出羊肚菌完全能夠單孢出菇；柴紅梅等[27]推測梯棱羊肚菌是一種特殊的假同宗子囊菌。

在羊肚菌栽培技術研究方面，目前大規模商業化栽培仍然以依托外源營養袋進行室外大田、大棚栽培為主，栽培技術上基本沒有很大的創新，且實踐中仍然存在大面積栽培區域不出菇或產量低的情況，栽培風險高，雖然也探索了一些新的栽培模式，但尚未進行大規模商業化栽培推廣及驗證[2，6，11-12]。

不斷完善羊肚菌外源營養栽培技術，解析外源營養的作用機制可有效保證羊肚菌實現穩產、高產。但目前對羊肚菌外源營養的作用機制研究較少。唐昊等[28]對梯棱羊肚菌分解利用外源營養袋的過程進行多組學結合生理生化分析，認為營養袋的主要作用是向土壤中的羊肚菌菌絲提供碳源，卻幾乎不向土壤產生氮的凈輸出。試驗前期通過15N同位素示蹤技術研究了羊肚菌人工栽培過程中外源氮素營養的運輸機制，證明了外源氮素營養能夠有效運輸到子實體中供其生長發育，同時，闡明了營養袋的時（擺放時間）空（有效距離）有效性問題。本研究在此基礎上進一步研究了梯棱羊肚菌補充2次外源營養的栽培技術。結果表明，第1次及第2次補充的外源營養中的氮素營養都能夠被土壤中的菌絲網絡吸收，并運輸到羊肚菌子實體中；試驗條件下，在梯棱羊肚菌播種后的第40天～第50天（此時處于菌絲階段和原基發生階段）補充第2次外源營養，其外源氮素營養物質能夠有效運輸到羊肚菌子實體中，并顯著提高產量。這一結論將為羊肚菌產業發展提供更多的參考，為羊肚菌栽培技術創新、有效實現穩產和高產方面提供一定的理論依據。

羊肚菌栽培技術的研究，特別是在外源營養的作用機制、營養生長向生殖生長轉變的因素、羊肚菌與土壤和環境的適應性等方面的研究還比較薄弱，在今后的研究中需進一步加強。試驗過程中還發現羊肚菌在完成采收后，土壤自然恢復1個星期，再重新補充外源營養能夠促進土壤中的菌絲再次萌發和聚集，在環境條件適宜時能夠形成原基并分化成幼菇。這些現象同樣表明在環境適宜時連續補充外源營養能夠連續收獲子實體，但補充外源營養的次數、時間、數量、方式等還有待進一步深入研究。