基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治心肌梗死的作用機制*

鄭 佳，王永霞，胡宇才，朱智琦，任紅杰，陳 鵬，喬利杰，李 彬

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是由冠狀動脈短暫或永久性閉塞，心肌發(fā)生嚴重、持續(xù)的缺血缺氧引起局部壞死所導(dǎo)致的嚴重心血管疾病，是我國心血管疾病的重要致死因素之一[1]。據(jù)《中國心血管疾病與健康報告2020》要點解讀[2]顯示，2002—2018年急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的病死率總體呈上升態(tài)勢，嚴重威脅人們的生命和健康。因此，如何有效防治MI迫在眉睫。目前，西醫(yī)治療MI主要以藥物治療、介入手術(shù)、冠狀動脈內(nèi)溶栓、冠脈搭橋為主，但各種手術(shù)治療均存在不可預(yù)知的并發(fā)癥。中醫(yī)藥在預(yù)防介入術(shù)后再狹窄、防治再灌注后無復(fù)流、改善患者臨床癥狀、提高患者生活質(zhì)量、增加活動耐量和改善患者遠期預(yù)后等方面具有獨特優(yōu)勢，已逐漸成為臨床治療心肌梗死的重要手段[3]。中醫(yī)學(xué)認為，心肌梗死可歸為“胸痹”“真心痛”范疇。《靈樞·厥病》曰：“真心痛，手足清至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死。”由此可知，該病為胸痹之重癥。該病基本病機為氣虛、寒凝、痰瘀痹阻，主要治則為益氣溫陽通絡(luò)、活血祛痰。調(diào)脂通絡(luò)膠囊是由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑調(diào)脂膠囊和冠心舒樂膠囊合方優(yōu)化篩選而成，自1993年起運用于臨床。相關(guān)實驗研究[4-6]表明，調(diào)脂膠囊和冠心舒樂膠囊不但具有顯著的抗動脈粥樣硬化、調(diào)脂作用，而且在防治冠心病、心絞痛方面有很大優(yōu)勢。調(diào)脂通絡(luò)膠囊是由上述兩種藥優(yōu)化篩選出紅參、紅曲、三七、血竭、皂角刺5味中藥組方，其防治冠心病心肌梗死的作用機制有待進一步的循證支持。筆者基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析調(diào)脂通絡(luò)膠囊的活性成分及作用靶點，明確藥物-活性成分-靶點-疾病之間的相互作用關(guān)系，繼而系統(tǒng)揭示其治療MI的藥理機制，為進一步研究調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治MI提供新的研究思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件使用

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；TCMIP數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)；PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.SwissTargetprediction.ch/)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)；Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)；DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http: //www.disgenet.org)；OMIM數(shù)據(jù)庫((https://www.omim.org)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Veney 2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；Cytoscape 3.7.2軟件；OmicShare 基迪奧生物信息云平臺(http://www.omicshare.com)。

1.2 調(diào)脂通絡(luò)膠囊活性成分的獲取及篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“紅參”“三七”“紅曲”“皂角刺”“血竭”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲取相關(guān)的活性成分信息，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥18%為條件對活性成分進行篩選。未檢索到活性成分的藥物，通過TCMIP數(shù)據(jù)庫及文獻檢索進行補充。在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取篩選后所得到的活性成分的標準Smiles結(jié)構(gòu)。

1.3 調(diào)脂通絡(luò)膠囊活性成分作用靶點的獲取

使用活性成分的Smiles結(jié)構(gòu)在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中對藥物作用靶點進行預(yù)測，并以Probability≥0%為條件進行靶點篩選。將在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫與TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得的藥物靶點進行整合，得到所有的藥物作用靶點。通過UniProt數(shù)據(jù)庫對藥物靶點進行標準化。

1.4 心肌梗死相關(guān)靶點的獲取

在TTD數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫以“myocardial infarction”為關(guān)鍵詞進行檢索并整合，獲取疾病相關(guān)靶點。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物作用靶點與疾病靶點導(dǎo)入Venny 2.1軟件中取交集，獲取治療MI的潛在作用靶點，并繪制韋恩圖。將潛在作用靶點導(dǎo)入功能蛋白締合網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“multiple proteins”，種屬設(shè)定為“homo sapiens”，進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值為“highest confidence”(0.900)，隱藏游離點，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型(PPI)，并導(dǎo)出string interactions數(shù)據(jù)，運用Cytoscape 3.7.2進行可視化。通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體(GO)生物過程分析、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在作用進行GO富集分析及KEGG通路分析。以P<0.05作為篩選條件，獲得GO富集分析結(jié)果和KEGG 通路分析結(jié)果，通過OmicShare繪制KEGG氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)脂通絡(luò)膠囊活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及TCMIP數(shù)據(jù)庫獲得符合篩選標準的調(diào)脂通絡(luò)膠囊的活性成分37個，其中紅參4個、三七8個、皂角刺11個、血竭14個、紅曲0個。經(jīng)文獻[7-8]補充后，獲取紅曲活性成分5個。去除重復(fù)值，共獲得31個活性成分。其中度值較高的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等。

2.2 調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治心肌梗死作用靶點的預(yù)測

將活性成分的Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，設(shè)置條件為Probability≥0%，將所得靶點與TCMSP數(shù)據(jù)庫中所得靶點合并，獲得調(diào)脂通絡(luò)膠囊所有靶點。檢索TTD數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲得與心肌梗死相關(guān)的疾病靶點。將調(diào)脂通絡(luò)膠囊所有靶點與疾病靶點導(dǎo)入Venny 2.1軟件，最終獲得潛在作用靶點138個，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-心肌梗死靶點韋恩圖

2.3 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-心肌梗死蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

將上述獲得的138個潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.7.2進行可視化，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共有113個節(jié)點，348條邊。面積越大，邊越粗，代表 Degree 越高；Degree越高，表明該靶點與其他靶點的相關(guān)性越明顯，在網(wǎng)絡(luò)中越重要[9]。經(jīng)排序，Degree 值排名前三的核心靶點分別為抑癌基因(TP53)、蛋白激酶(AKT1)、促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，這3個靶點在網(wǎng)絡(luò)中與其他靶點的相關(guān)性明顯，在整個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐作用，可能是調(diào)脂通絡(luò)膠囊治療心肌梗死的關(guān)鍵靶點。

圖2 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-心肌梗死蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將5種中藥、31個活性成分、138個潛在作用靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件進行相連，繪制調(diào)脂通絡(luò)膠囊-活性成分-靶點-心肌梗死相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。其中三角形代表藥物，六邊形代表疾病，箭頭代表活性成分，橢圓形代表靶點。圖中可見多個靶點對應(yīng)同一活性成分，一個靶點也可與多個活性成分相對應(yīng)，表明調(diào)脂通絡(luò)膠囊治療心肌梗死具有多成分、多靶點的特點，也體現(xiàn)出中藥方劑的復(fù)雜性與整體性。

圖3 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-活性成分-靶點-心肌梗死相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對138個潛在靶點進行GO富集分析。GO富集分析包括生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個部分，結(jié)果顯示，富集到生物過程相關(guān)條目共548條，細胞組分相關(guān)條目共60條，分子功能相關(guān)條目共104條。根據(jù)富集基因數(shù)排序，選擇GO富集分析的前10個結(jié)果用柱狀圖表示，見圖4。由圖4可知，GO富集分析主要涉及細胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達的正向調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程，胞質(zhì)溶膠、細胞外空間、細胞外區(qū)等細胞組分，以及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合等分子功能。

圖4 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-心肌梗死共同靶點GO功能富集分析圖

2.6 KEGG通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對138個潛在作用靶點進行KEGG通路分析，共富集到149條信號通路。選擇KEGG通路分析中與心肌梗死密切相關(guān)的前20條，采用OmicShare繪制氣泡圖，見圖5。由圖5可見，顯著性較高的通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化等。

圖5 調(diào)脂通絡(luò)膠囊-心肌梗死共同靶點KEGG通路分析圖

3 討 論

調(diào)脂通絡(luò)膠囊由紅參、三七、血竭、紅曲、皂角刺5味中藥組成，其中紅參益氣補脾、活血化瘀，三七散瘀止血、活血定痛，血竭活血化瘀、消炎止痛、收斂止血、軟堅散結(jié)，紅曲活血化瘀、健脾消食，皂角刺拔毒排膿、活血消腫。諸藥合用，共奏活血化瘀、利濕化痰之效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅參中的化學(xué)成分人參皂苷 Rg1可通過提高氧自由基清除能力，抑制炎性因子表達，從而抑制冠心病大鼠心肌細胞凋亡[10]；人參皂苷Rb1還能顯著增加抗凋亡蛋白的表達，降低促凋亡蛋白的表達，起到抑制心肌細胞凋亡的目的[11]。三七可降低血脂，預(yù)防動脈粥樣硬化，降低血壓，降低心肌收縮力和耗氧量，改善心肌供血情況，在冠心病的整個治療過程中發(fā)揮一定的作用[12]。LI C等[13]研究顯示，急性心肌梗死小鼠經(jīng)血竭預(yù)處理后，白細胞介素-6(IL-6)、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(p-STAT3)顯著上調(diào)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活，并調(diào)節(jié)其下游靶蛋白血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、環(huán)氧化物酶2(COX2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，促進心肌細胞增殖，調(diào)節(jié)心肌代謝，從而使心肌免受損傷。閆翔等[14]觀察紅曲改善老年冠心病患者頸動脈粥樣斑塊及血脂的療效，結(jié)果顯示，紅曲可通過調(diào)控血脂、改善血管內(nèi)皮功能，穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑塊，促進斑塊逆轉(zhuǎn)，從而減輕或防止冠狀動脈硬化進展。范科華等[15]給予急性心肌梗死模型犬皂角刺提取物等藥物灌腸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皂角刺提取物可以改善模型犬的心臟舒張順應(yīng)性，降低急性心肌梗死后心臟舒張壓及平均動脈壓，增加 MI 后冠狀靜脈竇血氧含量，降低氧耗量，增強心肌細胞對缺氧的耐受，起到縮小心肌梗死范圍的作用。雖然現(xiàn)代研究已對調(diào)脂通絡(luò)膠囊各個組成成分的藥理學(xué)作用進行了明確闡釋，但調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治MI的作用機制仍有待明確。

筆者基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對調(diào)脂通絡(luò)膠囊治療心肌梗死的作用機制進行系統(tǒng)研究，共發(fā)現(xiàn)調(diào)脂通絡(luò)膠囊31個活性成分，其中度值較高的為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等。何亞磊等[16]研究表明，槲皮素可顯著減輕心肌缺血再灌注損傷引起的心肌組織損傷，改善心臟功能，抑制心肌組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。嚴寧等[17]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可能通過ERK1/2信號通路緩解心肌缺血再灌注大鼠出現(xiàn)的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，并抑制其心肌細胞的凋亡。鄒小艷等[18]探討山柰酚對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型的保護作用及抑制脂代謝和細胞凋亡作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚可減輕心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死面積，改善冠狀動脈血流，減少心肌標志酶乳酸脫氫酶(LDH)的漏出，改善灌注后左心室收縮功能。據(jù)此推測，調(diào)脂通絡(luò)膠囊可能主要通過以上成分發(fā)揮作用。

本次研究共預(yù)測到138個治療MI的潛在靶點，其中，度值較高的為TP53、Akt1、MAPK1等。此外還存在B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)等與細胞凋亡相關(guān)的靶點。TP53是一種腫瘤抑制因子，研究[19-20]表明，TP53是維持心血管生理功能與病理過程的關(guān)鍵，可調(diào)節(jié)代謝與心臟結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的表達，還可通過抗血管生成、促凋亡、促自噬、促壞死調(diào)節(jié)心血管疾病的進展,在心肌缺血再灌注損傷和梗死后心室重構(gòu)期間參與調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、自噬和壞死。Akt1是蛋白激酶B的一種亞型，與心血管系統(tǒng)關(guān)系密切，可調(diào)節(jié)心臟生長、冠狀血管生成。研究表明，環(huán)形RNA可通過激活A(yù)kt1磷酸化和核易位減輕心肌損傷后心肌細胞凋亡，增強心臟修復(fù)能力[21]。MAPK1也稱為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2，可通過纖維化信號級聯(lián)蛋白影響心肌纖維化，調(diào)控細胞凋亡，保護心肌免受缺血再灌注損傷[22]。GO功能分析結(jié)果顯示，調(diào)脂通絡(luò)膠囊主要通過調(diào)控基因表達、細胞凋亡、缺氧等方面參與心肌梗死的治療。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，調(diào)脂通絡(luò)膠囊主要通過脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切力和動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-17(IL-17)、細胞凋亡、信號通路p53等信號通路發(fā)揮降脂、抗炎、抑制細胞凋亡的作用。目前認為，流體剪切力是動脈阻塞或嚴重狹窄后動脈生成的主要觸發(fā)因素，可改善缺血組織血循環(huán)，促進血管新生[23-24]。國外研究[25]表明，體外心臟震波可以形成快速而短暫的剪切力，促使血管內(nèi)皮生長因子上調(diào)、血管內(nèi)皮細胞增殖、缺血組織中毛細血管新生，改善豬AMI模型的冠脈側(cè)支循環(huán)。TNF信號通路是維持組織穩(wěn)態(tài)和防止炎癥病理的關(guān)鍵，與細胞存活和凋亡相關(guān)[26]。IL-17家族成員參與機體免疫調(diào)節(jié)，并且在不同的疾病中發(fā)揮著不同的作用。其家族包括6種細胞因子，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。其中，IL-17A是家族的原型，也是家族中最重要的炎癥因子。研究[27]表明，IL-17A參與多種心血管疾病的發(fā)病過程，包括動脈粥樣硬化、高血壓病、病毒性心肌炎和擴張性心肌病等。細胞凋亡是指基于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主、程序性的死亡方式。心肌梗死發(fā)生時，心肌缺血缺氧，自由基大量生成、鈣超載導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生過多及清除不足，活性氧在體內(nèi)積聚引起氧化損傷，最終導(dǎo)致心肌細胞凋亡。Bcl-2、Bax屬于Bcl-2家族，是目前已知的細胞凋亡中最核心的兩個基因。Bcl-2為凋亡抑制基因，可通過維持 Ca2+的動態(tài)平衡、拮抗促凋亡蛋白的表達和穩(wěn)定細胞線粒體膜來抑制細胞凋亡[28]。Bax為促凋亡基因，可與Bcl-2形成異二聚體而啟動信號通路，導(dǎo)致線粒體損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡[29]。Bcl-2/Bax的比值決定了細胞凋亡的發(fā)生與否[30]。改善 Bcl-2和(或) Bax 蛋白表達，增加Bcl-2/Bax比值，可降低心梗后心肌細胞的凋亡率[31]。

本課題組前期探討調(diào)脂通絡(luò)膠囊對MI大鼠心功能及細胞凋亡相關(guān)基因的影響[32]，根據(jù)冠心病的發(fā)病機制建立大鼠心肌缺血再灌注模型，探討調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治心肌缺血再灌注損傷的可能藥理學(xué)機制。研究結(jié)果顯示，調(diào)脂通絡(luò)膠囊能夠改善血脂異常，降低總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)在血清中的含量，與阿托伐他汀具有等效性；同時能夠改善心功能，抑制心肌凋亡，提高心肌梗死大鼠存活率，其作用機制可能與上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bax的表達、上調(diào)Bcl-2/Bax的比值有關(guān)。此外，前期的基礎(chǔ)研究[33-36]還證實，調(diào)脂通絡(luò)膠囊可以抑制心肌梗死后血清中群體反應(yīng)性抗體(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、心鈉肽ANP、腦鈉肽(BNP)、TNF-α、IL-6含量，延緩心室重構(gòu)進程；可使LDH、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、內(nèi)皮縮血管肽1(ET-1)含量均明顯降低，缺血區(qū)心肌組織一氧化氮(NO)及內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的含量明顯升高，縮小心肌梗死范圍，改善心肌病理形態(tài)，降低心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡率，對再灌注損傷的心肌有延遲保護作用。以上研究結(jié)論為調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治冠心病藥物機制研究和臨床運用提供了相應(yīng)的實驗依據(jù)，此與以上KEGG通路富集結(jié)果相一致。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治心肌梗死的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)脂通絡(luò)膠囊可能通過槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等多個活性成分，作用于TP53、Akt1、MAPK1、Bal-2、Bax等多個疾病靶點，通過脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切力和動脈粥樣硬化、TNF、IL-17、細胞凋亡、信號通路p53等多個信號通路發(fā)揮降脂、抗炎、抑制細胞凋亡的作用。此結(jié)果不僅佐證了本課題組前期對調(diào)脂通絡(luò)膠囊的研究結(jié)論，也為進一步研究調(diào)脂通絡(luò)膠囊防治心肌梗死的藥理機制提供了新的思路與方向。