魚源無乳鏈球菌N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NalA的鑒定及生物學功能分析

董雨豪，徐艷楠，聶蒙，曹青，姬姝婷，劉廣錦，劉永杰

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，又稱B群鏈球菌(Group BStreptococcus, GBS)，可引起奶牛乳腺炎、腦膜炎及新生兒敗血癥，也可導致魚類鏈球菌病，是一種感染宿主范圍較廣的病原菌[1]。自2009年以來，我國南方多個省市的羅非魚養殖場大規模暴發無乳鏈球菌病，由于感染魚死亡率極高，造成了嚴重的經濟損失，甚至給羅非魚的養殖生產造成了毀滅性打擊。病魚常見癥狀主要有：精神萎靡、眼球突出、腹部膨大、軀體平衡喪失并狂游[2]。該菌的致病性與多種毒力因子密切相關，如β-溶血素、CAMP因子、莢膜多糖和C5a肽酶等[3]。雖然對無乳鏈球菌毒力因子已進行了大量研究，但其確切的致病機制尚不清楚。

肽聚糖是革蘭陽性菌細胞壁的重要組成部分，在維持細胞完整性、防止細胞在低滲溶液中脹裂等方面起重要作用[4]。當細胞分裂時，肽聚糖會發生動態重構，其過程需要肽聚糖水解酶的參與。肽聚糖水解酶主要功能是切割肽聚糖層，將新合成的肽聚糖插入其中，以維持肽聚糖的循環利用[5]。肽聚糖水解酶根據其作用位點差異，可分為三大類：切割多糖骨架的糖苷酶、切割側鏈肽的酰胺酶以及切割側鏈多肽內部的肽鏈內切酶[6]。肽聚糖水解酶幾乎參與了細胞的整個生長過程，包括細胞生長、分離、自溶、細胞壁翻轉等。另外，肽聚糖水解酶在細菌運動性、蛋白分泌以及致病性方面也發揮重要作用[4]。在細胞壁重構過程中，肽聚糖水解酶還可以通過修剪細胞壁，消除宿主天然免疫受體所能識別的肽聚糖片段，進而抑制宿主免疫應答。例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)肽聚糖水解酶Atl通過修剪細胞壁表面裸露的肽聚糖末端，導致細菌不能被宿主的肽聚糖識別蛋白(PGRPs)識別，從而使細菌成功入侵宿主[7]。肽聚糖水解酶在無乳鏈球菌中的研究相對較少，目前僅有一種肽聚糖水解酶PcsB被鑒定[8]。

本研究在無乳鏈球菌GD201008-001基因組中預測到一個可能的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(A964_0097，命名為nalA)，采用同源重組技術構建基因缺失株及互補株，并研究該基因敲除后細菌形態變化、自溶能力以及對斑馬魚致病力的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與試劑

魚源無乳鏈球菌GD201008-001分離自廣州肇慶羅非魚養殖場中發病羅非魚。大腸桿菌DH5α購于南京諾維贊生物技術有限公司；溫敏型自殺質粒pSET4s (壯觀霉素抗性，大小為4 506 bp)和穿梭質粒pSET2(壯觀霉素抗性，大小為5 016 bp)由本實驗室保存；無乳鏈球菌培養條件為Todd-Hewitt broth (THB)液體培養基、溫度37 ℃。大腸桿菌DH5α培養條件為Luria-Bertani(LB)液體培養基、溫度37 ℃。

PrimeSTAR Max DNA聚合酶、2×PCR PreMix、反轉錄及熒光定量試劑盒均購自南京諾維贊生物技術有限公司；限制性內切酶、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒購自TaKaRa公司；細菌質粒提取試劑盒、細菌RNA/DNA提取試劑盒均購自OMEGA公司；壯觀霉素購自鼎國生物技術有限公司。Triton X-100、Tris-HCl、三卡因甲基磺酸鹽等其他試劑均為國產或進口分析純試劑。試驗相關引物(表1)均為自行設計并由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 蛋白生物信息學分析

檢索無乳鏈球菌GD201008-001基因組(NC_018646),發現A964_0097被注釋為N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，命名為nalA。采用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/) 軟件和SMART(http://smart.emblheidelberg. de/)軟件對該基因進行二級結構預測，采用I-TASSER(https://zhanggroup.org//I-TASSER/)軟件進行蛋白三維結構建模。

1.3 基因缺失株構建

以GD201008-001菌株基因組為模板，對nalA基因上下游同源臂進行PCR擴增，引物分別為nalA-A/B和nalA-C/D。產物再用nalA-A/D引物進行同源臂融合。融合PCR產物連接至pSET4s中，構建的nalA基因缺失重組質粒轉化至大腸桿菌DH5α中。將10 μL濃度為200 ng/μL的重組質粒電轉至無乳鏈球菌GD201008-001感受態中，電轉儀參數設置為：200 Ω、2.3 kV/cm、25 μF。電轉液置于28 ℃培養4 h，加入壯觀霉素，終濃度為100 μg/mL， 28 ℃培養過夜。

取適量菌液涂布至THB平板(含100 μg/mL壯觀霉素)，37 ℃培養過夜。挑取單菌落接種至THB液體培養基(含100 μg/mL壯觀霉素)中，37 ℃培養過夜，然后按1∶100體積比轉接至THB液體培養基中，每8 h傳代一次。連續傳代5次后，取等量稀釋菌液分別涂布于抗性和非抗性平板，37 ℃過夜培養。當抗性平板上菌落數量明顯少于非抗性平板上的菌落時，說明雙交換已發生，可挑取非抗性平板上的菌落，分別劃線于抗性和非抗性平板，37 ℃過夜培養。選取在僅在非抗性平板上生長的菌落進行菌落PCR驗證。缺失株用nalA-1/2引物對缺失基因上下游ORF進行PCR擴增，擴增產物送公司進行測序，以確定nalA基因的缺失是否導致上下游ORF的移碼。

1.4 基因互補株構建

以GD201008-001基因組為模板，利用引物CnalA-F/R進行PCR擴增獲得nalA片段，產物連接至pSET2載體，電轉化至ΔnalA缺失株感受態中。后續步驟同基因敲除。

1.5 細菌形態觀察

采用革蘭染色法將無乳鏈球菌野生株、ΔnalA和CΔnalA進行染色，在100倍油鏡下觀察菌體形態、成鏈長度和染色特性，并拍照記錄。

1.6 細菌自溶試驗

參照Yamada[9]方法進行細菌自溶試驗。將野生株、ΔnalA及CΔnalA培養至OD600=0.6，5 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體重懸于50 mmol/L含0.05% Triton X-100的Tris-HCl 溶液(pH=7.0)中，調至OD600=0.6。37 ℃輕微振蕩孵育，每隔4 h使用分光光度計測定吸光度OD600值。按照如下公示進行細菌自溶能力計算：

1.7 生長曲線測定

野生株、ΔnalA及CΔnalA生長至對數期，調至OD600=0.5，按1∶100轉接至50 mL THB培養基中，37 ℃培養24 h。每隔1 h使用分光光度計測定吸光度OD600值，繪制生長曲線。

1.8 半數致死量(LD50)測定

動物實驗按照動物福利標準進行，并經南京農業大學實驗動物倫理委員會批準(SYXK(Su)2017-0007)。各菌株接種于THB培養基，37 ℃培養至對數期。5 000 r/min離心5 min，PBS洗3次。調整濃度至5×104、2.5×104、5×103、2.5×103CFU/mL。每組15尾斑馬魚。斑馬魚先用100 μg/mL三卡因甲基磺酸鹽(MS-222)進行浸泡麻醉，然后用胰島素注射器每尾腹腔注射20 μL菌液，空白對照注射等量PBS。觀察1周記錄結果，按Bliss法[10]計算LD50。

1.9 數據統計與分析

采用Graphpad prism 5軟件進行分析處理，使用t檢驗進行差異顯著性分析。每個試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。*表示差異顯著，P<0.05; **表示差異極顯著，P<0.01。

2 結果

2.1 NalA蛋白的二級和三級結構預測

用PRABI軟件對NalA蛋白的二級結構預測，結果顯示52～186位氨基酸殘基為G73氨基葡糖苷酶結構域 (圖1A)。通過I-TASSER進行同源建模后得到NalA蛋白的三維結構，結果顯示 C 端催化結構域由1個β發卡結構和7個α螺旋構成，其中催化活性位點Glu115位于β發卡結構中(圖1B)。通過蛋白結構分析推測該蛋白為糖苷水解酶G73家族中的一種肽聚糖水解酶。基于BLAST比對結果，利用MEGA 7.0軟件構建基于NalA氨基酸序列的進化樹。結果顯示，無乳鏈球菌GD201008-001的NalA與S.agalactiaeFSL S3-026的肽聚糖水解酶(登錄號：WP_001231505.1)同源關系較近，且氨基酸序列相似性為99.48%(圖2)。

A. 二級結構預測；B. 二維結構圖1 NalA蛋白結構分析

圖中方框內所示為本研究蛋白NalA圖2 NalA氨基酸序列進化樹分析

2.2 nalA基因缺失株及互補株的PCR鑒定

用引物nalA-A/D對野生株和ΔnalA進行PCR驗證，結果顯示，野生株可檢測到長度為2 285 bp的產物，即目的基因片段及上下游片段長度。缺失株擴增片段為1 317 bp，即目的基因上下游片段長度。同時，使用目的基因內部引物nalA-F/R進行驗證，結果顯示野生株可檢測到目的基因擴增產物，而缺失株未檢測到目的基因擴增產物，以上結果表明nalA基因缺失株構建成功(圖3A)。另外，用nalA-1/2引物對缺失基因上下游ORF進行PCR擴增，擴增產物送公司進行測序，結果顯示nalA基因的缺失未導致上下游ORF的移碼。用nalA基因內部引物nalA-E/F進行PCR驗證，結果顯示在互補株中可檢測到目的基因，說明nalA基因成功回補(圖3B)。

A．缺失株PCR鑒定；M為DNA分子量標準 (DL 5000)；1為野生株，引物為nalA-F/R；2為野生株，引物為nalA-A/D；3為缺失株，引物為nalA-F/R；4為缺失株，引物為nalA-A/DB．互補株PCR鑒定；M為DNA分子量標準 (DL 2000)；1為野生株，引物為CnalA-F/R；2為互補株，引物為CnalA-F/R圖3 nalA基因缺失株及互補株PCR鑒定

2.3 實時熒光定量PCR驗證nalA基因轉錄水平

采用qRT-PCR對野生株、ΔnalA和CΔnalA進行目的基因轉錄情況驗證。結果顯示，ΔnalA無目的基因轉錄(P<0.01)，而野生株和CΔnalA均能檢測到目的基因的轉錄，且nalA基因的缺失不影響上下游基因的轉錄(圖4)。

***表示差異極顯著(P<0.01)圖4 nalA基因缺失株及互補株qRT-PCR鑒定

2.4 菌株的生長曲線測定

以培養時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制野生株、ΔnalA缺失株與CΔnalA互補株的生長曲線。如圖5所示，與野生株相比，ΔnalA缺失株的生長速率在對數生長期有明顯下降，但達到平臺期所用時間一致，CΔnalA互補株的生長能力與野生株基本相同。

圖5 野生株、ΔnalA及CΔnalA生長曲線

2.5 菌株的自溶測定

通過測定菌液OD值評估各菌株的自溶能力，結果顯示，前4 h，ΔnalA的自溶程度與野生株基本相同，4 h后ΔnalA的自溶程度開始放緩，基本沒有繼續發生自溶，而野生株的自溶程度直到16 h后才明顯放緩(圖6)，24 h時，ΔnalA的自溶能力降低69.36%。以上試驗結果表明，nalA基因的缺失可顯著降低細菌自溶的發生(P<0.01)。

**表示差異極顯著，P<0.01圖6 野生株、ΔnalA及CΔnalA自溶能力

2.6 細菌形態觀察

野生株、ΔnalA及CΔnalA革蘭染色后顯微鏡下觀察：3個菌株形態均為球狀，排列成鏈狀；與野生株(圖7A)相比，ΔnalA缺失株(圖7B)的細菌鏈增長約10倍，而CΔnalA互補株(圖7C)的細菌鏈長恢復到接近野生株水平。

A. 野生株；B. ΔnalA缺失株； C. CΔnalA互補株圖7 野生株、ΔnalA缺失株和CΔnalA互補株的形態學比較

2.7 對斑馬魚的LD50

如表2所示，野生株對斑馬魚的LD50為1.31×102CFU，ΔnalA對斑馬魚的LD50為5.87×102CFU，與野生株相比升高約4倍?；匮analA后，LD50恢復至野生株水平。結果表明nalA的缺失減弱了無乳鏈球菌對斑馬魚的致病力。

表2 斑馬魚致病性試驗

3 討論

本研究首先對無乳鏈球菌可能的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NalA進行二級和三級結構預測，結果顯示NalA的催化結構域由1個β發卡結構和7個α螺旋構成，且催化活性位點位于β發卡結構中，此結構與肽聚糖水解酶LytB[11]和自溶素Auto[12]的催化結構非常相似，表明這3種糖苷水解酶可能具有相同的底物結合方式和催化機制。為進一步明確其功能，利用同源重組技術成功構建該基因缺失株ΔnalA及互補株CΔnalA，并對其生物學特性進行初步分析，證實ΔnalA的生長速率在對數生長期有明顯下降。有研究報道，金黃色葡萄球菌的胞壁質水解酶LytN缺陷可延緩細菌的生長[13]；糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的胞壁質水解酶可降解環境中的高甘露糖型糖蛋白，釋放單糖促進細菌生長[14]，推測本研究鑒定的NalA可通過降解生長環境中的某些物質，為無乳鏈球菌對數生長期的迅速增殖提供營養。

當處于脅迫環境時，細菌會發生自溶現象。自溶現象是菌體在脅迫環境下維持生存的一種自我保護行為。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶屬于肽聚糖水解酶的一種, 與細菌自溶存在密切聯系[15]。本研究中ΔnalA的自溶能力顯著降低，說明該基因參與無乳鏈球菌的自溶過程。但nalA基因的缺失并未導致菌體自溶的停止, 表明無乳鏈球菌的自溶受到多種酶的調節, 而NalA可能只是其中關鍵的自溶酶。自溶酶不僅影響菌體的自溶, 而且決定著菌體的形態。革蘭染色鏡檢發現ΔnalA菌體形態與野生株無明顯差異，均為球形，但其排列成鏈的長度顯著長于野生株，說明NalA是無乳鏈球菌細胞分散所必需的肽聚糖水解酶, 可能主要通過切割子代細胞與母代細胞細胞壁的連接實現二者的分離。類似的現象在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)[16]和乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)[17]也有報道。在戈登鏈球菌(Streptococcusgordonii)中發現，肽聚糖水解酶lytB基因的缺失同樣可導致細菌鏈的增長[18]。本研究發現nalA的缺失導致無乳鏈球菌對斑馬魚的致病力顯著降低，推測NalA可能通過破壞細胞壁內肽聚糖的化學鍵，導致細胞表面特性(細胞壁結構、電荷、表面修飾)的改變，進而影響細菌表面毒力因子的展示。在產單核細胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes)中，胞壁質水解酶ispC基因的缺失可降低毒力因子ActA和InlC的表面展示，從而降低細菌對小鼠的致病力[19]。另外，有研究表明細菌鏈的增長可以降低細菌的抗吞噬能力從而降低細菌毒力。例如，在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)中，長鏈狀的肽聚糖水解酶缺失株ΔlytA更容易被補體系統識別，從而導致其更容易被中性粒細胞捕獲[20]。

綜上，本研究鑒定了一種新的無乳鏈球菌N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NalA，并對其生物學特性進行研究，為進一步探索該蛋白結構和功能奠定了基礎。