克淋通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

康紹建 趙琪鐘 侯安國(guó)

1.云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心，云南 昆明 650011；2.普洱市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 普洱 665000；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

泌尿系統(tǒng)感染通常指腎臟、輸尿管、膀胱、尿道各個(gè)部位感染的總稱,嚴(yán)重威脅人類健康[1-2],尿路感染是繼呼吸系統(tǒng)及消化道之后的第三位感染性疾病?？肆芡z囊由頭花蓼(四季紅)、黃柏等二味藥制成，具有清熱解毒、利濕通淋作用,臨床上常用于治療泌尿系統(tǒng)感染。對(duì)頭花蓼的藥理研究[3-4]表明,其對(duì)泌尿系統(tǒng)感染有抗菌作用，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀是黃柏的主要化學(xué)成分，其鹽酸小檗堿具有抑制炎癥反應(yīng)[5-8]、抗病原微生物的作用[9-11],巴馬汀也具有抗炎作用[12-13],這些作用皆與克淋通膠囊用藥功效一致?？肆芡z囊原標(biāo)準(zhǔn)[標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS-11282-(ZD-1282)-2002]中僅有頭花蓼的薄層鑒別和鹽酸小檗堿的HPLC法含量測(cè)定，故為了更好地控制此膠囊劑的質(zhì)量，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升研究，本試驗(yàn)在克淋通膠囊原標(biāo)準(zhǔn)中增加了黃柏和關(guān)黃柏的薄層鑒別，同時(shí)采用HPLC法建立了頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測(cè)定方法[14-20]，為克淋通膠囊的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 The Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀；PM4-1300TL超聲儀；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)；Sartorius CPA225D電子分析天平(十萬分之一)；Sartorius BS224S電子分析天平(萬分之一)。

1.2 試藥 克淋通膠囊由貴州聯(lián)盛藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)1402100、1402110、1402120、1402130、1402150)。沒食子酸對(duì)照品(110831-201605)(含量以90.8%計(jì))；關(guān)黃柏對(duì)照藥材(批號(hào):120937-201408)；黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：121510-201606)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201814)；鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào)：110732-201913)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈為色譜純、由美國(guó)默克公司生產(chǎn)；水為純凈水；甲醇、磷酸等其它試劑均為分析純。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠、默克股份兩合公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏薄層鑒別 稱取供試品粉末0.2 g，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液25 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.1 g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加鹽酸-甲醇混合溶液(1∶100)制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典通則0502 )試驗(yàn)，吸取上述對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各1～3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲醇-異丙醇-水(6∶3∶2∶1.5∶0.3)為展開劑，點(diǎn)板展開，晾干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。結(jié)果如圖1所示。

1.克淋通膠囊(批號(hào):1402100);2.克淋通膠囊(批號(hào)：1402110);3.克淋通膠囊(批號(hào)：1402120);4.鹽酸小檗堿對(duì)照品(110713-201814);5.黃柏對(duì)照藥材(121510-201606);6.陰性樣品(缺黃柏);T= 22.7 ℃ RH=68.4%圖1 黃柏薄層鑒別圖

2.2 關(guān)黃柏薄層鑒別 精密稱取供試品粉末 0.1 g，加甲醇10 mL，加熱回流15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取關(guān)黃柏對(duì)照藥材0.1 g，按上述方法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸巴馬汀對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取關(guān)黃柏供試品溶液1～2 μL，對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，點(diǎn)板展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)。結(jié)果如圖2所示。

1.黃柏對(duì)照藥材(121510-201606);2.克淋通膠囊(批號(hào)：1402100);3.關(guān)黃柏對(duì)照藥材(120937-201408);4.克淋通膠囊(批號(hào)：1402110);5.鹽酸小檗堿對(duì)照品(110713-201814);6.克淋通膠囊(批號(hào)：1402120);7.鹽酸巴馬汀對(duì)照品(110732-201913);T= 22.0 ℃ RH=65.4%圖2 關(guān)黃柏薄層鑒別圖

2.3 含量測(cè)定(頭花蓼)

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%磷酸(5∶95)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm，進(jìn)樣體積 10 μL。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)，應(yīng)不低于2500。

取適量的沒食子酸對(duì)照品，以50%甲醇溶液稀釋，紫外-可見分光光度計(jì)選擇在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)其光譜圖，沒食子酸對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)為216 nm，因此該方法檢測(cè)波長(zhǎng)確定為216 nm。

2.3.2 對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸對(duì)照品11.68 mg，至50 mL棕色容量瓶中，加50% 甲醇溶液溶解并稀釋至刻度。精密吸取5～50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液 精密稱取取本品內(nèi)容物 0.2 g，置具塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密移取50%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液 根據(jù)處方制備不含頭花蓼的陰性樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 依據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，測(cè)定。結(jié)果表明，在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處，供試品溶液有沒食子酸特征吸收峰，而陰性對(duì)照液無相應(yīng)吸收峰，表明專屬性良好。如圖3～5所示。

圖3 沒食子酸對(duì)照品圖

圖4 陰性樣品圖

圖5 克淋通膠囊樣品圖

2.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液(0.02121 mg/mL)2、5、10、15、20、30 μL進(jìn)樣，記錄高相液相色譜，以沒食子酸峰面積為橫坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(μg)為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程為：Y=0.0001X-0.0002(r2=1)，沒食子酸在0.04242～0.6363 μg之間線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液(0.02121 mg/mL)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒食子酸峰面積，結(jié)果峰面積RSD=0.59%，說明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)(批號(hào):1402100)樣品6份,按上述“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法,平行處理并測(cè)定,結(jié)果6 次測(cè)得沒食子酸平均含量為2.8558 mg/g，RSD=1.25%；表明重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性考察 按上述“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫條件下每2小時(shí)進(jìn)樣1次，以峰面積計(jì)算， RSD為1.48%(n=7)；結(jié)果表明室溫條件下，供試品溶液中芍藥苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.10 準(zhǔn)確度考察 精密稱取6份已知濃度(2.8558 mg/g)供試品(批號(hào)1402100)各0.1 g，裝入具塞錐形瓶中，各自精密加入沒食子酸對(duì)照品溶液(濃度0.01818 mg/mL)15 mL,按上述“2.3.3”項(xiàng)下方法制備所需溶液，照含量測(cè)定方法項(xiàng)下操作，測(cè)定供試品溶液中沒食子酸的含量，計(jì)算沒食子酸的平均回收率為99.76%，RSD為0.25%。上述結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.11 含量測(cè)定 按上述色譜條件，依法測(cè)定5批樣品中沒食子酸的含量。結(jié)果如下表2。

表2 5批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)采用TLC法對(duì)克淋通膠囊中黃柏和關(guān)黃柏進(jìn)行了定性鑒別，其結(jié)果分離度好，專屬性強(qiáng)。同時(shí)通過HPLC法建立了克淋通膠囊頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測(cè)定方法，經(jīng)過HPLC方法學(xué)考察以及對(duì)5批克淋通膠囊樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可作為克淋通膠囊頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測(cè)定方法[21-22]。

3.1 提取溶劑的選擇 采用稀乙醇，30%甲醇,50%甲醇為提取溶劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為50%甲醇時(shí)，提取效果最好，故選用50%甲醇。

3.2 提取方法的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)通過對(duì)50%甲醇超聲提取30 min、加熱回流提取30 min、索氏提取 2 h 及3 h比較，其中索氏提取2 h所得含量最低，索氏提取3 h所得含量接近超聲提取30 min和加熱回流提取30 min；超聲提取效果較好且簡(jiǎn)便快捷，故選用超聲提取方法。

3.3 提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)通過對(duì)50%甲醇超聲提取10 min 、15 min、30 min比較，實(shí)驗(yàn)表明超聲提取15 min和超聲提取30 min所得含量測(cè)定值接近；故選用超聲提取15 min。

3.4 流動(dòng)相的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)分別以乙腈-甲酸、乙腈-水，甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明，甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜圖峰形好，分離效果好。故本研究選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

3.5 柱溫的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)分別以20、25、30 ℃為柱溫進(jìn)行考察。為減少時(shí)間且分離效果較好，故本研究柱溫選擇30 ℃。

綜上所述，在克淋通膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了黃柏和關(guān)黃柏的薄層鑒別方法及有效成分指標(biāo)沒食子酸的含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)單易行，為完善和提高克淋通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。