嗜熱鏈球菌發酵鰱魚制品工藝參數的優化

楊闖徐燦蘭時樂

（1上海海洋大學水產與生命科學學院，上海 201306；2湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

發酵魚制品具有甜咸適中、風味獨特、醇香濃郁、營養豐富等特點，深受國內外消費者的喜愛。目前，我國市場上常見的發酵魚制品主要包括酒糟魚[1]、臭鱖魚[2-3]、發酵酸魚[4-5]、魚露[6-7]、發酵魚粉[8]等，其制作過程主要采用傳統鹽漬發酵法。關于發酵魚制品的研究，主要集中在發酵菌種的分離篩選[9-11]、產品品質和風味[12-13]以及發酵過程中微生物群落演替變化規律[14-15]等方面。發酵溫度、制作環境、微生物菌群組成等諸多因素的影響，導致發酵魚制品質量不穩定、亞硝酸鹽含量高、發酵周期長和貨架期短，進而影響消費者對發酵魚制品的需求。為解決發酵魚制品存在的問題，本文通過人工接種嗜熱鏈球菌，系統研究發酵鰱魚的影響因素，并通過統計分析軟件對發酵條件進行優化，以期為發酵鰱魚制品的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。供試材料包括新鮮鰱魚、白砂糖、食鹽、邵陽大曲，市購；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），由筆者分離并鑒定。

1.1.2 主要試劑。主要試劑包括蛋白胨、牛肉浸取物、酵母浸取物、葡萄糖、乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、檸檬酸二胺、二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉，均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.1.3 主要儀器設備。主要儀器設備包括霉菌培養箱（MJ-160C，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；高壓滅菌鍋（SS-325，TOMY KOGYO 公司）；單人單面超凈工作臺[SW-CJ-1B（U），蘇州設備凈化有限公司]；組織搗碎勻漿機（JJ-2，常州市華普達教學儀器有限公司）；可見光度計（V5000，上海元析儀器有限公司）。

1.1.4 培養基。嗜熱鏈球菌斜面培養基：MRS固體培養基[16]。嗜熱鏈球菌液體種子培養基：葡萄糖30 g、20%大豆浸煮液1 000 mL。以上培養基于115℃條件下滅菌30 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌種子液制作。 將保存于斜面培養基上的嗜熱鏈球菌活化后，接種于液體種子培養基中，搖勻后于37℃培養箱中恒溫靜置培養24 h。

1.2.2 鰱魚預處理。將鰱魚去鰓、鱗、內臟和頭后切成小塊，洗凈后瀝干表面的水分，加入7%食鹽常溫下腌制2 d，平鋪于托盤中，55℃烘干表面水分。

1.2.3 發酵條件研究。將烘干的魚塊置于玻璃瓶中，分別改變食鹽添加量（5%、7%、9%、11%、13%）、白砂糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、酒精添加量（3%、5%、7%、9%、11%）、菌齡（24、48、72、96、120 h）、接種量（5%、10%、15%、20%、25%）和發酵時間（192、216、240、264、288 h）等，放于 37 ℃恒溫培養箱中培養，分別考察不同因素對鰱魚發酵的影響。

在單因素試驗結果的基礎上，用Design-Expert 8.0.5b軟件，以水溶性氨基酸為響應值（R1），選擇對發酵鰱魚質量影響較大的因素發酵時間（A）、菌齡（B）和接種量（C）為自變量進行響應面優化設計，每個自變量取3個水平。響應面分析因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平

1.3 測定內容與方法

1.3.1 理化成分檢測分析。取發酵好的魚制品按重量比加入20倍水，再用組織搗碎機充分搗碎，靜置10 min，取上清液按參考文獻[17-19]提供的方法測定發酵鰱魚的水溶性氨基酸、還原糖含量和pH值。

1.3.2 感官評定。根據評定標準對樣品進行感官評定。選擇由廚師、普通市民、學生等10人組成的評定小組，對產品的色澤、滋味、香氣、組織質地等逐一評分，計算綜合得分[20]，以總分表示樣品的總體感官品質。感官評分標準見表2。綜合得分計算公式如下：

表2 酒糟魚感官品質評分標準

2 結果與分析

2.1 食鹽添加量對鰱魚發酵的影響

從表3可以看出，在一定范圍內，隨著食鹽添加量的增加，水溶性氨基酸含量隨之增加。當食鹽添加量為7%時，水溶性氨基酸含量最高，達1.87%，當食鹽添加量超過7%時，水溶性氨基酸含量下降。同時也可以看出，發酵鰱魚中還原糖含量隨食鹽添加量的增加變化并不大，而pH值隨食鹽添加量的增加逐漸升高，說明提高食鹽添加量抑制了乳酸菌活性而影響了魚的發酵進程。從感官指標分析，除滋味在食鹽添加量為5%時分數較低外，其他指標差異不大。因此，綜合考慮理化指標和感官指標，確定食鹽添加量為7%進行后續試驗。

表3 食鹽添加量對鰱魚發酵的影響

2.2 白砂糖添加量對鰱魚發酵的影響

從表4可以看出，隨著白砂糖添加量的增加，感官評定參數中質地、色澤及綜合得分隨之增加，香氣降低，滋味得分變化不大，還原糖含量先降后升。當白砂糖添加量為5%時水溶性氨基酸含量最大，為1.94%。綜合考慮理化指標和感官指標，選取白砂糖添加量為5%進行后續試驗。

表4 白砂糖添加量對鰱魚發酵的影響

2.3 白酒添加量對鰱魚發酵的影響

從表5可以看出，隨著白酒添加量的增加，水溶性氨基酸含量逐漸降低，還原糖含量先升后降，感官指標得分及綜合得分差別不大，說明白酒添加量對感官指標得分和綜合得分無顯著影響。因此，確定白酒添加量為3%進行后續試驗。

表5 白酒添加量對鰱魚發酵的影響

2.4 菌齡對鰱魚發酵的影響

從表6可以看出，菌齡對發酵鰱魚制品的感官指標得分和pH值影響不大，但隨著菌齡增加，水溶性氨基酸含量呈先升后降的趨勢。當菌齡為72 h時，發酵鰱魚制品中水溶性氨基酸含量最大，達2.64%，菌齡超過72 h，水溶性氨基酸含量下降。因此，選擇菌齡為72 h進行后續試驗。

表6 菌齡對鰱魚發酵的影響

2.5 接種量對鰱魚發酵的影響

從表7可以看出，在一定范圍內，隨著接種量的增加，水溶性氨基酸含量也逐漸增加。當接種量為15%時，水溶性氨基酸含量最大，達2.72%；當接種量超過15%時，水溶性氨基酸含量顯著下降。還原糖含量隨接種量的增加而下降，推測原因可能是隨著接種量增加，乳酸菌生長繁殖和代謝所需要的營養物質較多，導致水溶性氨基酸和還原糖含量下降。各處理之間pH值和各感官指標得分差異不大。

表7 接種量對鰱魚發酵的影響

2.6 發酵時間對鰱魚發酵的影響

從表8可以看出，隨著發酵時間延長，發酵鰱魚中水溶性氨基酸和還原糖含量呈先升后降的變化趨勢。當發酵時間為240 h時，水溶性氨基酸和還原糖含量均最高，分別達到2.83%和0.75%；當發酵時間超過240 h，水溶性氨基酸和還原糖含量均顯著下降，pH值呈現持續下降趨勢，而感官指標得分在各處理之間差異不大。

表8 發酵時間對鰱魚發酵的影響

2.7 響應面法優化結果

2.7.1 Box-Benhnken響應面法試驗設計及結果。根據表9試驗結果，采用Design-Expert 8.0.5b軟件對試驗結果進行二次多項回歸擬合，獲得以水溶性氨基酸為響應值的回歸方程：

表9 嗜熱鏈球菌發酵鰱魚工藝響應面試驗設計及結果

R1=2.78+0.000 1A-6.250E-0.03B-1.250E-0.03C+0.000 2AB+0.000 1AC-2.500E-0.03BC-0.69A2-0.58B2-0.60C2

由表 10 可知，A2、B2、C2對水溶性氨基酸的影響極顯著（P＜0.01），說明發酵時間、菌齡、接種量是鰱魚發酵的重要因素，表明回歸方程的一次項、二次項的影響都是極顯著的。該模型回歸顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），說明數據中沒有異常點，模型適當，回歸方程擬合度良好。

表10 水溶性氨基酸響應面結果方差分析

2.7.2 二次回歸方程的方差分析。由表11可知，回歸方程的復相關系數為0.996 0，表明99.6%的水溶性氨基酸變化可由此模型解釋，與實際試驗擬合較好；校正相關系數為0.9887，預測相關系數為0.9784，兩者較為相近，說明其他因素的干擾較少。降解率變異系數為3.07%，信噪比28.637，說明該模型的可信度較高。因此，可以用上述模型代替真實試驗對鰱魚發酵品質進行分析和預測。

表11 二次回歸方程的方差分析

2.7.3 水溶性氨基酸的響應面分析。采用Design-Expert 8.0.5b軟件對水溶性氨基酸的回歸模型進行分析。等高線形狀可以反映各因素之間交互效應的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓則表示較顯著[21]。

發酵時間和菌齡對水溶性氨基酸含量的交互作用見圖1。由圖1可知：發酵時間不變時，隨著菌齡的增加，水溶性氨基酸含量呈現先上升后下降的趨勢；當菌齡不變時，水溶性氨基酸含量隨發酵時間的增加而增大，當發酵時間超過11 d時，游離水溶性氨基酸含量隨發酵時間的增大迅速下降，同時二者的等高線圖呈現明顯的橢圓，說明發酵時間和菌齡之間存在顯著的交互作用。

發酵時間和接種量對水溶性氨基酸的交互作用見圖2。由圖2可知，當發酵時間不變時，隨著接種量的增加，水溶性氨基酸含量呈現先顯著增長后顯著降低的趨勢。當接種量不變時，隨著發酵時間的增加，水溶性氨基酸含量呈現先增長后降低的趨勢。由等高線圖可以看出，二者的交互作用不顯著。

菌齡和接種量對水溶性氨基酸的交互作用見圖3。由圖3可知，接種量不變，隨著菌齡的增加，水溶性氨基酸含量呈現先上升后下降的趨勢。當菌齡不變時，隨著接種量的增加，水溶性氨基酸含量成呈上升后快速下降的趨勢，說明菌齡和接種量對水溶性氨基酸的交互作用顯著。

2.7.4 適宜的發酵條件。為確定適宜的發酵條件，將回歸方程分別對各自變量求一階偏導數并令其為0，可以得到三元一次方程組，對此方程組求解得到嗜熱鏈球菌發酵鰱魚最適宜的發酵條件，從而獲得最適宜的發酵條件組合：發酵時間255.12 h、菌齡68.16 h、接種量15.27%。在此條件下得到水溶性氨基酸理論產量為2.96%。

2.7.5 模型驗證。為了驗證模型的有效性，根據優化試驗所得的各因素優化值，即發酵時間為255 h、菌齡為68 h、接種量為15.3%進行驗證試驗，重復3次，得到水溶性氨基酸含量分別為2.92%、3.05%、3.01%，平均含量為2.993%。試驗值與理論值相對誤差為1.13%，說明試驗值與模型預測值擬合良好。

3 結論

嗜熱鏈球菌發酵鰱魚的工藝為：白砂糖添加量5%，白酒添加量3%，食鹽添加量7%，發酵時間為255 h，菌齡為68 h，接種量為15.3%。通過驗證，測得發酵魚中水溶性氨基酸平均含量為2.993%，與理論值相對誤差僅為1.13%，說明采用響應面分析法對利用嗜熱鏈球菌發酵鰱魚制備酒糟魚的工藝進行優化是有效的。