云斑白條天牛COI基因堿基序列長度與基因差異相關性比較

常志恒 梅增霞 李建慶 張 穎

（濱州學院生物與環境工程學院，山東濱州 256603）

云斑白條天牛為鞘翅目天牛科昆蟲，是我國重要的園林蛀干害蟲，在我國分布廣泛，危害寄主眾多，對很多園林樹木造成嚴重危害。據項目組調查，云斑白條天牛對黃河三角洲地區的白蠟樹和洞庭湖地區的楊樹造成的危害尤其嚴重[1-2]。因此，深入開展云斑白條天牛的遺傳分化機制研究，對掌握云斑白條天牛的生態習性和開展綜合防治具有重要意義。

線粒體基因具有分子量小、保守性好等特點，是研究昆蟲進化和遺傳多樣性的理想材料，線粒體DNA中應用最普遍的是細胞色素C氧化酶亞基I（COI）[3-4]。開展昆蟲線粒體基因遺傳多樣性研究過程中，提取、擴增獲得目的基因后，在DNA序列拼接輸出時，普遍面臨的問題是同一基因不同樣品獲得的堿基序列長度不一致。在進行遺傳分析時，是否必要將同一基因的堿基序列剪切為長度一致，這是在開展線粒體遺傳分析時需要解決的一個基礎問題。

本文以云斑白條天牛COI基因為例，分別提取、擴增了2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹的云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因，分析云斑白條天牛COI基因堿基序列長度與基因相關性，以確定在進行線粒體基因遺傳分析時是否必要將待分析基因的長度統一，為以后開展相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲于2014年6月和2019年6月在山東濱州城區采集；為害楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲于2014年6月在湖南岳陽、2019年5月在湖南沅江采集。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取、擴增與測序。利用動物基因組DNA提取試劑盒，提取云斑白條天牛總DNA。采用昆蟲線粒體COI基因通用引物，利用PCR試劑盒，擴增獲得COI基因，由生工生物（上海）股份有限公司完成測序。

1.2.2 DNA序列的拼接和剪切。利用DNAStar軟件完成COI基因的序列拼接和剪切，以及堿基含量分析和相似度比較。

通過DNAStar的SeqMan程序雙向拼接，不剪切，輸出獲得不同樣品的COI序列，稱為初始序列。將COI初始序列，根據MagAlign的比對結果，通過Edit Seq程序將初始序列兩端剪切一定數量的堿基，將不同樣品的COI基因堿基序列長度統一為640 bp，稱為剪切序列。

1.2.3 COI基因序列長度與基因差異相關性比較。利用初始序列，分別比較2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因序列差異；利用剪切序列，分別比較2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因序列差異。

將初始序列和剪切序列獲得基因差異結果進行比較，統計分析不同樣品COI基因序列長度在分析比較堿基差異時的必要性。

2 結果與分析

2.1 COI基因的初始序列堿基含量分析

由表1可以看出，為害白蠟樹云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因的初始序列長度在699～709 bp之間，平均為705 bp，2014年和2019年雌、雄成蟲堿基A+T含量均在65%以上，2014年雌成蟲4個堿基的含量順序由高到低為A＞T＞G＞C，2019年雌成蟲、2014年雄成蟲和2019年雄成蟲均為T＞A＞C＞G。為害楊樹雌、雄成蟲的COI基因的初始序列長度在663～713 bp之間，平均為699 bp，2014年和2019年雌、雄成蟲堿基A+T含量均在64%以上，2014年和2019年雌成蟲4個堿基的含量順序由高到低均為T＞A＞C＞G，2014 年雄成蟲為 A＞T＞G＞C，2019 年雄成蟲為 T＞A＞C＞G。

表1 云斑白條天牛成蟲COI基因初始序列堿基含量比較

2.2 COI基因剪切序列的堿基含量分析

將云斑白條天牛COI基因的初始序列剪切為640 bp，剪切序列的堿基含量見表2。可以看出，為害白蠟樹云斑白條天牛2014年和2019年雌、雄成蟲堿基A+T含量均在65%以上，2014年和2019年雌、雄成蟲4個堿基的含量順序均與初始序列的堿基含量分析結果一致。為害楊樹云斑白條天牛2014年和2019年雌、雄成蟲堿基A+T含量均在64%以上，2014年和2019年雌、雄成蟲的4個堿基的含量順序均與初始序列的堿基含量分析結果一致。

表2 云斑白條天牛成蟲COI基因剪切序列堿基含量比較

2.3 不同樣品COI基因初始序列相似度比較

由表3可知，為害楊樹云斑白條天牛雌成蟲在2014年和2019年之間相似度最高，為98.0%；其次是為害白蠟樹雌成蟲；再次是為害白蠟樹雄成蟲；為害楊樹雄成蟲相似度最小，為97.0%。針對同一寄主的雌、雄成蟲，為害白蠟樹雌成蟲在2014年和2019年之間相似度（97.9%）大于雄成蟲（97.6%），為害楊樹雌成蟲相似度（98.0%）大于雄成蟲（97.0%）。

表3 云斑白條天牛COI基因初始序列的堿基相似性比較

2.4 不同樣品COI基因剪切序列相似度比較

將初始序列剪切為640 bp，按相同方法分析比較2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲COI基因序列的相似度，結果見表4。可以看出，為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛的雌、雄成蟲的COI基因在2014年和2019年之間相似度均大于用初始序列分析獲得的相似度，增加最多的是為害楊樹雄成蟲，增加了1.9個百分點；增加最小的是楊樹雌成蟲，增加了1.5個百分點。序列剪切統一長度后相似度增加的主要原因是剪掉了序列開始和末端的一些不一致堿基。

表4 云斑白條天牛COI基因剪切序列的堿基相似性比較

2.5 COI基因初始序列與剪切序列相似度比較

從圖1可以看出，利用剪切序列分析2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲的COI基因相似度與利用初始序列分析獲得的結果基本一致，2014年和2019年之間相似度由大到小依次是為害楊樹雌成蟲、為害白蠟樹雌成蟲、為害白蠟樹雄成蟲、為害楊樹雄成蟲，略有不同之處在于為害楊樹和為害白蠟樹雌成蟲由大于變成了相等；為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌成蟲相似度大于雄成蟲，為害白蠟樹種群雌、雄蟲的平均相似度大于楊樹種群。

3 結論與討論

在開展云斑白條天牛COI基因研究時，發現不同文獻和不同樣本COI基因序列長度不一致。禹海鑫等[4-5]分析白條天牛屬10種天牛共12個樣品的線粒體COI基因的堿基序列時，將12個樣品的COI基因序列長度統一剪切為434 bp。陸鵬飛等[6]分析栗癭蜂（Dryocosmus kuriphilus）的11個不同寄主種群COI基因遺傳多態性時，將11個樣品序列長度統一為660 bp。本研究拼接的云斑白條天牛COI初始序列長度在663～713 bp之間，剪切序列統一長度640 bp，相同樣品委托他人檢測所得序列長度為658 bp。再根據COI基因的DNA電泳檢測的Marker標記，筆者認為COI基因的堿基序列在600～700 bp之間應該都是合適的。

根據本研究利用同一樣品的初始序列和剪切序列，分別分析了2014年和2019年為害白蠟樹和楊樹云斑白條天牛雌、雄成蟲堿基序列的堿基含量和相似度，發現序列長度變短后，堿基含量變化較小；序列相似度變大，但不同樣品之間相似度差異規律沒有發生變化。因此，筆者認為，COI基因堿基序列長度統一剪短后，堿基含量及序列相似度都會發生改變，但變化的幅度不大，對定性分析的結果影響不大。因此，是否需要將堿基序列統一長度，研究者可根據自己的研究需要自行判斷。