草莓種子實(shí)生苗病毒分子檢測

繆軍 馬秀明 孫楊 蘭成云 王俊峰 韓偉

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家蔬菜改良中心山東分中心，山東濟(jì)南 250100）

草莓是薔薇科草莓屬多年生常綠草本植物，染色體基數(shù)為x=7。現(xiàn)代草莓栽培品種均屬于八倍體鳳梨草莓（Fragaria×ananassa Duch.，2n=8），其適應(yīng)性較強(qiáng)，在世界各地均有栽培，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。草莓具有生長周期短、結(jié)果早、連續(xù)坐果能力強(qiáng)、見效快等優(yōu)點(diǎn)，深受種植者青睞；又因其果實(shí)味道酸甜、香氣濃郁、外形美觀、顏色艷麗而深受廣大消費(fèi)者喜愛[1-3]。

草莓可通過匍匐莖、分株和種子等進(jìn)行繁殖，生產(chǎn)中主要采用匍匐莖產(chǎn)生子苗的方法繁育草莓苗，這種營養(yǎng)繁殖技術(shù)可以保持草莓品種的優(yōu)良遺傳性狀。但是，該繁育方法也導(dǎo)致草莓同其他無性繁殖的植物一樣，一旦感染病毒就會傳染給子代[2-3]。生產(chǎn)上長期采用無性繁殖，導(dǎo)致植株積累了多種病毒，引起草莓葉片皺縮，植株矮化弱小，果實(shí)畸形、品質(zhì)變劣，產(chǎn)量下降等現(xiàn)象，且危害逐年累加[4-5]。目前，已報道的侵染草莓的病毒種類達(dá)20余種，其中普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重的主要有4種，即草莓鑲脈病毒（SVBV）、草莓斑駁病毒（SMoV）、草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）和草莓皺縮病毒（SCV）[2-3，5-7]。

為了探索一套高效、快捷、簡便的脫毒方法，研究人員嘗試了高溫脫毒、超低溫脫毒、化學(xué)試劑脫毒、微莖尖組織培養(yǎng)脫毒、高溫-莖尖培養(yǎng)結(jié)合、二次培養(yǎng)脫毒和花藥組織培養(yǎng)脫毒等方法[8-10]。同時，為了檢驗(yàn)其是否脫除病毒，還要進(jìn)行無病毒檢測鑒定，鑒定方法有指示植物法、電鏡檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等[2-3，11-12]。可見，現(xiàn)有的草莓脫毒苗繁育體系雖有了長足的發(fā)展，但是其成本高、難度大、技術(shù)水平要求高，必須組培快繁結(jié)合病毒檢測鑒定。因此，有必要探索一套簡便、高效、免檢的繁育體系，以促進(jìn)草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

SVBV、SMoV、SMYEV、SCV 草莓病毒主要由蚜蟲、飛虱、薊馬等傳播，也可以通過嫁接和菟絲子傳播，但不能通過種子或花粉傳播[13-14]。因此，采用種子繁殖可以避免上述病毒傳播，但需要克服草莓種子繁殖后代遺傳特性不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。荷蘭、日本和加拿大等國已開始種子繁殖型草莓新品種的選育和生產(chǎn)[15-16]。本試驗(yàn)旨在探索種子發(fā)芽方法，并驗(yàn)證種子實(shí)生苗是否攜帶病毒，以助推種子繁殖型草莓的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

脫毒草莓材料經(jīng)莖尖組培脫毒獲得，取幼葉若干片。帶毒草莓材料為田間采集的病葉。種子實(shí)生苗通過如下步驟獲得：種子來自田間自然授粉的草莓漿果，品種有章姬、紅顏、甜查理和白雪公主。當(dāng)草莓果實(shí)成熟后適時采摘，削下草莓果皮貼在干燥的吸水紙上晾干，3～4 d后，在果皮表面揉搓、采集種子。種子發(fā)芽采用直浸法，即在培養(yǎng)瓶中倒入1/4的滅菌水，將種子浸泡其中，3～5 d換1次水，直到發(fā)芽、子葉展開。將小苗定植在穴盤或小花盆中，基質(zhì)澆透水，1穴（盆）定植1株；初期注意保濕，長出2片真葉后正常管理，5～6片葉時采集樣品。將上述材料放入液氮或-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物

特異性擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)，根據(jù)GenBank中NC_001725的基因序列設(shè)計(jì)和合成針對SVBV的引物，上游為GAATGGGACAATGAAATGAG，下游為AACCTGTTTCTAGCTTCTTG；基于 AJ311875和 AJ3 11876序列設(shè)計(jì)合成針對SMoV的引物，上游為TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG，下游為 ATTCG GTTCACGTCCTAGTCTCAC；基于NC_003794序列設(shè)計(jì)合成針對SMYEV的引物，上游為CCGCTGCAG TTGTAGGGTAC，下游為CATGGCACTCATTGGAGC TGGG；基于NC_043064序列，設(shè)計(jì)合成針對SCV的 引物對 SCV-F（TTCAGGACCTATTTGATGACA）、SCV-R（CATTGGTGGCAGACCCATCA）[5-7]。 用草莓肌動蛋白基因Actin引物（Actin-F GGGTTTGCTGGAG ATGATGC，Actin-R TCTCCTTGCTCATCCTATCAGC）驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄的質(zhì)量[11-12]。研究中所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 RNA的制備

按照試劑盒的說明進(jìn)行總RNA的提取，所用試劑盒為FastPureRPlant Totol RNA Isolation Kit（Polysaccharides/Polyphenolics-rich）多糖多酚植物RNA提取試劑盒，由南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 反轉(zhuǎn)錄

按照HiScriptRII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)）說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒特異性擴(kuò)增

將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR擴(kuò)增的模板，對每個樣品先進(jìn)行Actin的擴(kuò)增，確定反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量良好后，再分別進(jìn)行4種病毒的特異擴(kuò)增。30 μL RT-PCR反應(yīng)體系：dd H2O 12 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 正、 反向引物各 1 μL，Taq mix 15 μL。 反應(yīng)程序：預(yù)變性 94 ℃2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸5 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物、EB染色、凝膠成像儀觀察。

1.6 多重PCR擴(kuò)增

在單一引物對PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，同時在一個PCR反應(yīng)體系中加入多對引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，對多重RT-PCR體系的擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓種子直浸法發(fā)芽

草莓種子一直浸泡在水中可以正常發(fā)芽，不同品種發(fā)芽時間不同，有的品種發(fā)芽時間為7 d左右，有的2～3個月（圖1）。種子發(fā)芽后，將小苗定植在盛有基質(zhì)的穴盤或小花盆中，1穴（盆）定植1株（圖2），可以達(dá)到獲得種子實(shí)生苗的目的。

2.2 草莓總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄體系的檢測

用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA后，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用Actin-F和Actin-R為引物，各樣品擴(kuò)增出了預(yù)期891 bp大小的特異片段（圖3），說明根據(jù)肌動蛋白基因設(shè)計(jì)的引物適合作為草莓病毒檢測的內(nèi)標(biāo)。以此基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，一方面可以檢測RNA質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄的質(zhì)量，另一方面可以排除假陰性結(jié)果的干擾，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 單一RT-PCR檢測草莓病毒

根據(jù)設(shè)計(jì)的草莓鑲脈病毒（SVBV）、草莓斑駁病毒（SMoV）、草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）和草莓皺縮病毒（SCV）的特異引物，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，逐個進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠瓊脂糖電泳，能得到單一的清晰條帶，SMoV和SVBV大小分別為461 bp和278 bp左右（圖3），符合預(yù)期目的片段大小。樣品1為組培脫毒苗，沒有擴(kuò)增出條帶，說明此脫毒苗脫毒比較徹底，未受這4個主要病毒的感染；樣品2、3、4為田間病樣，樣品3、4擴(kuò)增出SMoV目的大小的條帶，說明它們被草莓斑駁病毒侵染；樣品2、4擴(kuò)增出SVBV目的大小的條帶，說明它們是草莓鑲脈病毒侵染的樣品；樣品4既能擴(kuò)增出SMoV條帶，又能擴(kuò)增出SVBV條帶，說明此病株可確定為草莓斑駁病毒和草莓鑲脈病毒復(fù)合侵染的樣品；樣品5、6、7、8，用這4對引物均不能擴(kuò)增出條帶，說明種子來源的不同品種實(shí)生苗都不攜帶這4種病毒。

用SMYEV和SCV特異性引物對所有樣品進(jìn)行檢測，均未擴(kuò)增出目的片段，說明采集的樣品都不含有草莓皺縮病毒和草莓輕型黃邊病毒。

2.4 多重RT-PCR檢測草莓病毒

根據(jù)單一RT-PCR的檢測結(jié)果，把SMoV和SVBV 4條引物同時加入每一個含不同模板的PCR管中，可同時檢測這2個病毒（圖3），樣品2擴(kuò)增出SVBV目的大小的條帶，樣品3擴(kuò)增出SMoV目的大小的條帶，樣品4同時擴(kuò)增出SMoV和SVBV目的大小的條帶，檢測結(jié)果同單一引物分別檢測的結(jié)果一致。建立了同時檢測草莓斑駁病毒和草莓鑲脈病毒2種病毒的多重RT-PCR方法。

3 結(jié)論與討論

草莓種子果皮較厚，吸水透氣性差，還可能含有導(dǎo)致休眠的抑制物質(zhì)，其發(fā)芽時間和發(fā)芽率在不同品種間有很大差異，出苗也不整齊，播種后有的品種僅需10 d就可發(fā)芽，有的品種90 d才能發(fā)芽[17-19]。本試驗(yàn)把草莓種子始終浸泡在水里，可以保證種子充分吸收水分，同時也可能稀釋導(dǎo)致休眠的抑制物質(zhì)，有利于發(fā)芽。此方法的優(yōu)點(diǎn)是便于操作，可根據(jù)發(fā)芽的先后順序依次定植。用此法獲得的實(shí)生苗可以滿足本試驗(yàn)的需求，其是否優(yōu)于其他發(fā)芽方法有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

草莓葉片組織富含多糖類、芳香族的酚類化合物，使其核酸提取比較困難，特別是總RNA的提取，一般提取方法很難奏效，該試驗(yàn)所用適于多糖多酚的試劑盒能較好地解決此問題。總RNA反轉(zhuǎn)錄后，先用Actin引物擴(kuò)增檢驗(yàn)質(zhì)量，擴(kuò)增效果較好，健康與帶病毒試材均可很好地?cái)U(kuò)增，增加了試驗(yàn)的可靠性，避免了假陰性的出現(xiàn)。

SVBV是DNA病毒，SMoV、SMYEV、SCV是 RNA病毒。單獨(dú)檢測SVBV可以總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于DNA的提取比較簡單快捷且成本不高，比較省時省力。SVBV雖然是DNA病毒，但是被侵染的植物組織中存在病毒基因的轉(zhuǎn)錄本，因而在同時檢測4種病毒時，可以利用RT-PCR進(jìn)行SVBV的檢測，不必再另外提取DNA[20]。雖然SMYEV和SCV特異性引物在本試驗(yàn)缺少陽性對照，但根據(jù)已有報道，這些引物是有效的[5-6，12]，也能說明采集的樣品中都不含有SCV和SMYEV。再則，多重RT-PCR擴(kuò)增可減少試劑損耗，縮短操作時間，達(dá)到了省時省力的效果[21]。

目前，草莓脫毒技術(shù)雖然有了長足的發(fā)展，但是利用現(xiàn)有脫毒技術(shù)獲得的苗木并不能保證完全脫除了病毒。因此，將這些草莓植株作為生產(chǎn)母株之前，還需進(jìn)行病毒檢測鑒定。因此，組培脫毒技術(shù)結(jié)合病毒檢測鑒定技術(shù)，其操作環(huán)節(jié)繁多、難度較大、資源浪費(fèi)比較嚴(yán)重，需要進(jìn)一步探索簡便、高效、符合生產(chǎn)實(shí)際的繁育體系，促進(jìn)草莓產(chǎn)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展。

日本、荷蘭和加拿大等國家，成功培育出遺傳特性穩(wěn)定的種子繁殖型草莓品種[15-16]。種子實(shí)生苗培育可以在較小的面積上經(jīng)過較短的時間獲得較多的植株，方法簡易、成本低、效率高、適合大規(guī)模的專業(yè)化生產(chǎn)。這項(xiàng)技術(shù)打破了草莓生產(chǎn)只能用匍匐莖育苗的傳統(tǒng)觀念，既可減少農(nóng)藥使用量，也能很好地控制草莓病害，從而在降低成本、提高效率等方面均有明顯貢獻(xiàn)，是草莓生產(chǎn)技術(shù)的一次革命性突破[15-16]。本試驗(yàn)證明了種子繁育的草莓后代不攜帶病毒，有助于推動種子繁殖型草莓品種的選育、推廣和應(yīng)用。