miR-25-3p表達水平與急慢性肝衰竭預后的關系探討

黃明，彭彬，辛大平，房仲平

(廣安市人民醫院 肝膽外科，四川 廣安 638001)

急慢性肝衰竭在慢性肝病患者中較常見，臨床癥狀包括腹水、凝血障礙、黃疸等，在肝衰竭中占比高達60%，我國慢性乙肝(chronic hepatitis B，CHB)患病率較高，導致與之相關的急慢性肝衰竭發生率也較高[1-2]。目前，由于肝衰竭缺乏特效藥物進行干預，主要通過積極對癥處理控制病情，盡早診療是預防并發癥、降低死亡率的關鍵，早期診療對疾病轉歸而言至關重要。既往臨床通過癥狀表現、肝功能檢查等對急慢性肝衰竭進行輔助評估，雖然有一定價值，但對預后評價的效果欠佳[3]。近年來，研究發現微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)對可編碼蛋白基因有調控作用，能通過與某些編碼基因結合，在肝病中發揮作用[4]。有學者指出微小核糖核酸-25-3p(miR-25-3p)表達可能與機體重要臟器功能(如肝、肺、心等)受損有關，但具體機制不詳[5]。考慮到慢性肝衰竭患者伴有明顯的肝損害，本研究擬分析miR-25-3p表達水平與急慢性肝衰竭預后的關系，尋求與該病相關的新預測標志物以及干預靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入我院2018年9月至2020年9月收治的急慢性肝衰竭患者84例作為肝衰竭組，選取同期收治的CHB患者77例作為CHB組，選取同期于我院體檢的健康志愿者60例作為對照組。研究方案經倫理委員會批準，3組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組基線資料的比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 (1)肝衰竭組：滿足《肝衰竭診治指南(2018年版)》[6]中的相關診斷標準者；年齡≥18歲者；就診時行肝功能檢查、血清miR-25-3p檢測者；對研究內容知情同意者。(2)CHB組：滿足《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中關于CHB診斷標準者；未見CHB相關的并發癥者；年齡≥18歲者；乙型肝炎表面抗原陽性持續時間超過6個月者；能配合完成相關檢查者；知情同意者。(3)對照組：同期體檢的健康志愿者，肝功能正常；年齡≥18歲者；可配合檢查者；簽署同意書者。

1.2.2 排除標準 因酒精、藥物所致肝損傷者；患有惡性腫瘤者；患脂肪肝、自身免疫性肝炎者；心、腦等臟器功能不全者；入院前1個月內有抗病毒治療史者。

1.3 方法

3組受試者均采集5 ml空腹肘靜脈血，分裝于兩管，一管用于檢測肝功能指標，另一管用于檢測乙肝病毒基因(Hepatitis B virus-DNA，HBV-DNA)及miR-25-3p。采血后離心10 min，轉速3 000 r·min-1，離心半徑8cm，分離血清，存放于-70 ℃待測。

1.3.1 肝功能指標檢測 采用海力孚HF-240全自動生化分析儀檢測血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平，吸取約20 μl血樣上機檢測。

1.3.2 HBV-DNA檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法檢測，儀器為杭州博日科技FQD-48A PCR檢測儀，HBV-DNA試劑由東北制藥集團股份有限公司提供，利用濃縮裂解法對HBV-DNA進行提取，擴增條件為93 ℃預變性2 min，93 ℃變性5 s，57 ℃退火、延伸45 s，40個循環，待反應完畢經電腦軟件分析定量結果。

1.3.3 血清miR-25-3p檢測 采用實時逆轉錄PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)法檢測，主要試劑為氯仿、異丙醇、蒸餾水，由Invitrogen公司配制，Trizol及miRNA試劑購自賽默飛世爾科技公司。主要儀器為TGL-16M型離心機(山東博科生物有限公司)、FQD-48A型PCR檢測儀(杭州博日科技有限公司)、F3系列微量移液器(賽默飛世爾科技公司)。具體方法如下：(1)提取與檢測總RNA。將存放于低溫環境內的血清取出，在室溫下復溫，取血清400 μl置于EP管內，取Total RNA 提取試劑1 ml加入，經移液槍吹打，在常溫下反應25 min；在4 ℃下離心10 min(12 000 r·min-1)；留取上清液放置于新EP管內，取氯仿200 μl加入，封蓋，振蕩混勻，室溫下反應15 min；在4 ℃下離心10 min(12 000 r·min-1)，此時樣本出現3層，分別為水樣層(上層)、中間層以及苯酚-氯仿層(下層)，RNA在上層水樣中；取異丙醇500 μl加入新EP管內，將上層水樣加入，在4 ℃下反應10 min，離心處理20 min(12 000 r·min-1)；將上清液移去，取75%乙醇1 ml加入，混合充分，在4 ℃下離心20 min(700 r·min-1)；將上清液去除，在室溫下靜置15 min，取去離子水25 μl加入，使RNA溶解；取總RNA 2 μl，測定RNA濃度、純度，如果A260/A280在1.8～2.0之間，則提示純度合格。(2)針對總RNA行逆轉錄，合成cDNA液，待反應完畢取出cDNA產物，迅速將其冷卻，行PCR檢測。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；92 ℃變性2 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，50個循環。引物序列如下：miR-25-3p上、下游序列分別為5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′、5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；以U6為內參引物，上、下游序列分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′、5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。待循環結束觀察溶解曲線的變化，檢測溫度、升溫速度以及恒溫時間分別為70～95 ℃、0.5 ℃·次-1、5 s·次-1，以2-ΔΔCT表示miR-25-3p表達水平。

1.3.4 隨訪分析 從患者住院開始觀察，直至觀察3個月結束，對出院的患者通過微信、電話進行隨訪，記錄預后情況，并將生存者納入生存組，死亡者納入死亡組，本次無失訪病例。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計數資料用百分比(%)表示，行χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，3組間比較采用方差分析，兩兩比較行獨立樣本t檢驗。急慢性肝衰竭患者血清miR-25-3p水平與肝功能指標及HBV-DNA的相關性采用Pearson線性相關分析，采用Cox多元回歸模型分析預后危險因素，繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線分析miR-25-3p評估預后的曲線下面積(area under the curve，AUC)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組血清miR- 25- 3p、肝功能指標及HBV- DNA的比較

肝衰竭組、CHB組的血清TBIL、AST、ALT水平高于對照組，血清miR-25-3p、ALB水平低于對照組；肝衰竭組血清miR-25-3p表達水平低于CHB組，血清TBIL、AST、ALT水平高于CHB組，差異均有統計學意義(P<0.05)；肝衰竭組與CHB組HBV-DNA比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-25-3p、肝功能指標及HBV-DNA比較 例

2.2 肝衰竭組患者血清miR- 25- 3p與肝功能指標、HBV- DNA的相關性

Pearson線性相關分析顯示，血清miR-25-3p與TBIL、AST、ALT呈負相關(分別為r=-0.524、P=0.007，r=-0.768、P<0.001，r=-0.741、P<0.001)，與ALB、HBV-DNA無相關性(分別為r=0.274、P=0.059，r=0.196、P=0.078)。

2.3 肝衰竭組不同預后患者血清miR- 25- 3p、肝功能指標、HBV- DNA比較

在84例急慢性肝衰竭患者中，3個月內生存55例(65.48%)，死亡29例(34.52%)。死亡組血清miR-25-3p表達水平低于生存組，血清TBIL、AST、ALT水平高于生存組，差異均有統計學意義(P<0.05)，兩組ALB、HBV-DNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 肝衰竭組不同預后患者血清miR-25-3p、肝功能指標、HBV-DNA比較

2.4 肝衰竭組患者預后的單因素及Cox多因素回歸分析

單因素分析顯示生存組與死亡組間ALB、HBV-DNA表達無差異，故此處將這兩項變量排除。以miR-25-3p、TBIL、AST、ALT均值為界賦值，以預后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，Cox多因素回歸分析顯示，血清miR-25-3p水平增高是預后的保護性因素，而血清TBIL、AST、ALT水平增高是預后的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 肝衰竭組患者預后的單因素及Cox多因素回歸分析

2.5 血清miR- 25- 3p評估急慢性肝衰竭預后的價值分析

ROC曲線顯示，血清miR-25-3p評估急慢性肝衰竭預后的AUC為0.768(標準誤0.058，P<0.001，95%CI0.654～0.883)，最佳界值為58.676，敏感度為88.20%，特異度為69.70%，見圖1。

圖1 血清miR-25-3p評估急慢性肝衰竭預后的ROC曲線

3 討 論

急慢性肝衰竭病情進展非常快，因受病程、發病誘因等因素影響，患者存在較大個體差異，隨著病程延長，可能引起肝性腦病、凝血功能障礙等并發癥，總體預后不理想[8]。研究表明miRNA在肝病中發揮了重要作用，它經轉錄后能對基因表達進行調控，與細胞凋亡、分化、增殖以及炎癥反應密切相關，在血清內存在穩定表達[9]。尋求可靠的miRNA指標，可能對急慢性肝衰竭評估有一定價值，從而發現新治療靶點。研究發現miR-25具有抗氧化損傷作用，能減少細胞凋亡，對機體臟器有保護作用，而一旦其表達異常，則會促進臟器損傷，例如心、肝、肺等均可能出現損害[10]。miR-25-3p是miR-25的3′端臂加工而產生的一種miRNA，現階段與之相關的研究較少，尚未完全明確其與肝衰竭之間的關系。本研究分析miR-25-3p在肝衰竭中的作用機制，觀察其與患者預后之間的關系，為臨床診療提供思路。

本研究結果顯示，急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p水平較CHB患者、健康體檢者明顯降低。既往關于miR-25-3p的報道較少，且主要集中于腫瘤領域，例如薛亞軍等[11]發現miR-25-3p能通過調節腫瘤細胞增殖參與食管鱗癌轉移過程，程燕等[12]研究顯示miR-25-3p對甲狀腺乳頭癌的診斷有一定價值。miR-25-3p的生物功能比較復雜，研究表明miR-25-3p表達對機體免疫系統有調節作用，其表達下調可能與免疫系統受損有關，提示機體存在免疫功能障礙[13]。另有學者發現miR-25-3p對炎癥反應有抑制作用，可通過下調炎癥介質表達減輕機體炎癥[14]。這表明miR-25-3p可能通過調節免疫、炎癥反應的機制保護機體功能。本研究顯示急慢性肝衰竭患者的血清miR-25-3p下調，這可能與免疫功能障礙有關。已有研究[15]證實免疫紊亂參與了肝衰竭進展，因患者出現肝臟損害，繼而可導致循環系統、腸道免疫監視等功能受損，削弱機體免疫，患者可能因免疫系統受損導致miR-25-3p表達下調。

本研究結果顯示急慢性肝衰竭患者血清TBIL、AST、ALT水平在3組中最高，表明患者出現明顯肝損害，與既往結論[16]基本吻合。肝衰竭的直接表現為肝功能惡化，涉及的機制比較復雜，主要與肝內炎癥、免疫紊亂、中性粒細胞失調等有關，可導致肝臟的解毒、轉運功能下降，促進肝損害[17]。此外，本研究顯示肝衰竭組的血清ALB下降，這對肝功能也有較大影響。ALB在血漿中存在表達，它是機體所需的一種重要蛋白質，在肝臟解毒與運轉中同樣發揮了重要作用，一旦ALB水平下降，則可致白蛋白功能、結構改變，削弱肝臟的解毒與轉運能力[18]。本研究顯示肝衰竭患者的血清miR-25-3p與TBIL、AST、ALT水平有相關性。miR-25-3p在肝衰竭中可能對機體功能有保護作用，在免疫功能障礙的情況下呈低表達，而肝衰竭患者機體處于免疫紊亂狀態，致血清miR-25-3p表達下調，免疫功能削弱不利于肝功能恢復，甚至可進一步加重肝損害。羅杰等[19]研究提示乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭患者的miR-25-3p表達下調超過2倍，其評估該病的曲線下面積高于0.800，表明miR-25-3p表達在肝衰竭中評估價值較高。miR-25-3p參與肝損傷的機制比較復雜，可能通過調節內源性Notch1信號通路或Wnt、Notch信號通路，在肝臟疾病中發揮作用[20]。本研究還提示血清miR-25-3p表達增高對急慢性肝衰竭預后有保護作用，且對預后有一定評估價值。miR-25-3p表達增高可能意味著患者的機體免疫狀態較好，能對臟器功能起到保護作用，為臟器恢復提供良好的內環境，對改善預后有益。蔡莉等[21]以糖尿病腎病小鼠進行研究發現，miR-25-3p能通過抑制機體炎癥保護小鼠的腎功能，這也提示miR-25-3p可在機體功能中發揮正向調控作用。目前，臨床針對miR-25-3p與肝病關系的研究較少見，本研究也尚處于初步探索階段，未來還需對此進行更深入探討。

miR-25-3p在急慢性肝衰竭患者血清中呈低表達，且與患者預后密切相關，其表達增高可能對預后有保護作用，臨床有望通過測定血清miR-25-3p水平對其預后進行預測。本研究局限性為樣本數據偏少，且尚未考慮地域、年齡等因素對miR-25-3p表達的影響，日后還須綜合考慮多種因素，進一步分析miR-25-3p的作用機制。