基于網絡藥理學探討溫腎宣痹方治療膝骨關節炎的作用機制

丁亮，茆軍，梅偉，王培民 ，黃利佳，廖太陽

(1.南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院 骨傷科，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210029)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是骨科常見病之一，它的主要病理特點為關節軟骨破壞、軟骨下骨硬化或囊性變、關節邊緣骨質增生、滑膜病變、關節囊攣縮、韌帶松弛或攣縮、肌肉萎軟無力等[1]。流行病學調查研究顯示，我國癥狀性KOA(診斷明確，存在膝關節疼痛等癥狀且需要就診)的患病率為8.1%，隨著我國人口老齡化程度加劇，該比例還會持續上升[2]。現代醫學多采取分級治療方式治療KOA，可根據患病程度分別采取基礎治療(患者教育、運動治療、物理治療、行動支持治療等)、藥物治療(口服鎮痛藥，關節腔藥物注射、口服中成藥等)、修復性治療(關節鏡手術、軟骨修復手術、力線矯正手術等)和重建性治療(單髁置換術、全膝關節置換術等)等方式治療，但都存在一定的局限性，包括藥物副作用、手術副作用、假體使用年限等[3]。中醫將KOA歸為“痹證”“骨痹”“筋痹”等范疇，現統稱為“膝痹”，證屬本虛標實、本痿標痹。主要病因病機為肝腎不足、風寒濕邪侵襲機體，導致膝部筋絡氣血不通，故而為痛為腫。溫腎宣痹湯是王培民教授由多年臨床經驗總結而來，該方以溫補腎陽、祛風除濕之藥為主，補氣強骨、利水滲濕、行氣活血止痛之藥為輔，強筋健骨同時用以利水藥疏利關節，補瀉并進，滋而不膩，諸藥合用共奏溫補腎陽、祛風除痹之功[4]。盡管該方臨床取得了一定療效，然而具體作用機制尚待研究，本研究旨在通過網絡藥理學的方法，就溫腎宣痹湯治療KOA的潛在作用機制加以探討，為基礎研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件

本研究使用的數據庫及軟件如下：中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，人類基因數據庫(The Human Gene Database，GeneCards)，人類基因及遺傳疾病在線目錄(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，DAVID生物信息學資源數據庫，蛋白互作與功能富集分析平臺(STRING)，Cytoscape軟件，R語言軟件，Perl軟件。見表1。

表1 相關數據庫及軟件

1.2 溫腎宣痹湯有效成分庫及靶基因庫

登錄TCMSP數據庫，分別以附子、桂枝、牛膝、獨活、桑寄生、薏苡仁、白術、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草為關鍵詞，檢索目前已知的每味中藥所含的有效成分，并進行初步篩選，條件為：口服生物利用度(OB)>30%，生物類藥性(DL)>0.18；構建溫腎宣痹湯的有效成分庫，同時通過TCMSP數據庫查詢以上重要的有效成分的作用靶點，并通過Perl軟件構建靶基因庫。

1.3 KOA靶基因庫構建

以knee osteoarthritis為關鍵詞，分別檢索GeneCards及OMIN數據庫，合并所查得的有關KOA相關的靶點，篩選并構建KOA相關靶基因庫。

1.4 交集基因庫構建

使用R語言軟件及Perl軟件，取得溫腎宣痹湯與KOA靶點基因的交集基因，并繪制Veen圖，得到溫腎宣痹湯-KOA共同靶點基因。

1.5 PPI網絡構建及核心靶基因篩選

將通過上述步驟得到的溫腎宣痹湯-KOA共同靶點基因輸入STRING數據庫，選擇Multiple Proteins Search，限定物種為Homo sapiens，保存下載TSV格式的分析結果，繪制蛋白相互作用網絡圖，并通過R語言計算每個靶點基因的度值(即靶點基因之間的相互連接數目)，取大于平均度值的靶基因為核心靶基因。

1.6 藥物成分-靶基因-疾病調控網絡的構建

利用Cytoscape軟件對STRING網站得到的結果與溫腎宣痹湯有效成分以及共同靶點基因進行分析，構建藥物成分-靶基因-疾病調控網絡，并對網絡圖中節點大小及顏色進行調整。

1.7 GO基因本體論與KEGG富集分析

將所得到的溫腎宣痹湯-KOA共同靶標基因輸入DAVID數據庫中進行分析計算，得出GO功能富集分析與KEGG富集分析的結果。

2 結 果

2.1 溫腎宣痹湯有效成分庫及靶基因庫

通過TCMSP數據庫，分別以附子、桂枝、牛膝、獨活、桑寄生、薏苡仁、白術、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草為檢索詞，設置OB和DL參數，篩選后共得到196個有效成分，對應靶點222個。見表2(僅部分顯示)。

表2 篩選后溫腎宣痹湯有效成分及其OB、DL

2.2 KOA相關基因庫

以knee osteoarthritis為檢索詞，分別檢索GeneCards數據庫以及OMIM數據庫，共得到KOA相關靶點基因2 064個。

2.3 溫腎宣痹湯-KOA交集基因庫

將上述檢索得到的222個中藥靶點基因與KOA相關靶點基因取交集，得到溫腎宣痹湯-膝骨性關節炎共同靶點基因116個，并使用R語言軟件繪制Veen圖。見圖1。

圖1 溫腎宣痹方與KOA靶點基因交集Venn圖

2.4 PPI網路構建及核心靶點基因篩選

將上述得到的116個中藥-疾病共同靶點輸入“STRING”數據庫，設置相關條件后運行得到靶基因蛋白互作網絡圖，見圖2。同時以大于平均度值為條件，篩選得到57個核心靶點基因，見圖3。

圖2 溫腎宣痹方治療KOA靶基因蛋白互作網絡圖

圖3 蛋白互作核心靶點條圖

2.5 藥物成分-靶基因-疾病調控網絡

通過Cytoscape軟件整合分析中藥復方溫腎宣痹湯的核心有效成分以及對應的藥物作用靶標基因與股骨頭壞死疾病共同基因之間的關系，構成溫腎宣痹湯-靶基因-KOA疾病調控網絡。見圖4。

圖4 溫腎宣痹方-藥物成分-靶基因-疾病調控網絡圖

2.6 GO基因本體論與KEGG富集分析

對核心靶基因進行GO本體論分析，得出溫腎宣痹湯治療KOA的核心分子功能主要涉及細胞因子活性、DNA結合轉錄因子結合、核激素受體結合、雌激素受體結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、激素受體結合、核受體結合、生長因子受體結合等。見圖5、6。

圖6 GO基因本體論分析柱狀圖

KEGG富集分析顯示，共篩選出溫腎宣94條溫腎宣痹湯治療膝骨性關節炎的潛在通路。主要涉及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等，見圖7、8。

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

溫腎宣痹湯是王培民教授在多年臨床實踐中探索而來的，該方由附子、桂枝、牛膝、獨活、桑寄生、薏苡仁、白術、秦艽、黃芪、威靈仙、炙甘草等組成。重用附子以溫腎扶陽、散寒止痛；桂枝辛溫，溫表陽以固衛氣，又祛風濕；白術健脾利濕化水，通經絡，配以薏苡仁增強其健脾利濕化水之功，緩解寒飲造成的疼痛；獨活辛苦微溫，祛伏邪之風，除蘊久之痹；秦艽、威靈仙共奏祛風除濕、舒筋活絡、通利關節之效，桑寄生、牛膝補益肝腎而強壯筋骨，輔以甘草，調和諸藥，輔以補益中焦，助扶正祛邪之用。

通過篩選我們共得到該方的有效成分196個，通過檢索得到其對應靶點222個，通過與KOA疾病靶點取交集后得到了57個核心靶點，其中評分前3名的靶點基因依次為IL-16、蛋白激酶B(PKB/AKT1)、血管內皮生長因子-A(VEGFA)。IL-6是一種炎癥介導因子，在人體各種炎癥過程中起到重要作用[5]。它由184個氨基酸組成，有兩種受體亞型，分別是mIL-6R-α和sIL-6R[6]。研究表明，KOA患者關節滑膜液與軟骨組織的IL-6表達水平較正常軟骨組織升高[7-8]，且血清IL-6的濃度與KOA患者疼痛程度及影像學嚴重程度呈正相關[9]，表明IL-6參與KOA的生理病理過程。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT)是磷脂酰肌醇激酶(PI3K)信號通路中重要的下游靶點，AKT1是其亞型之一。PI3K/AKT信號通路是軟骨細胞存活和凋亡的重要調節因子，除調節細胞增殖，還可通過抑制軟骨細胞死亡來減少軟骨退變，是對抗軟骨細胞凋亡的重要途徑[10]。PI3K/AKT/mTOR是骨關節炎(OA)中軟骨下骨的關鍵代謝途徑。創傷后OA小鼠模型軟骨下骨中AKT磷酸化增加，促進成骨分化和成骨細胞增殖，導致異常骨形成[11]。VEGF是一種具有重要促血管生成活性的生長因子，它同時也是炎癥細胞因子。它作用于多種細胞類型，具有多種功能，其功能包括刺激血管生成、單核細胞趨化、增強血管通透性和血管舒張等[12]。在晚期OA的關節軟骨、滑膜、滑膜液、軟骨下等部位均可檢測出VEGF表達，且與病情嚴重程度及疼痛程度呈正相關[13-15]。在VEGF家族中，VEGFA是在OA發病機制中被研究最多的亞型。有研究人員發現，VEGFA可促進基質金屬蛋白(MMPs)分泌，通過抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成和表達來抑制關節軟骨的變性[16]。

KEGG分析共得到94條相關通路，在排除與KOA關聯性較小的通路后，我們團隊認為溫腎宣痹湯治療KOA主要通過IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路發揮作用。IL-17是多種炎癥細胞因子之一，存在于關節滑膜及軟骨細胞中。OA患者血清和滑液中IL-17水平升高，且與病變的X線圖像所示嚴重程度呈正相關[17-19]。IL-17能抑制軟骨細胞合成蛋白多糖，促進MMPs組酶的產生[20]。此外，IL-17影響其他細胞因子和化合物的分泌，進而影響OA進程[21]。晚期糖基化終產物受體(RAGE)是免疫球蛋白家族的成員，是晚期糖基化終產物(AGEs)的受體，多種細胞如巨噬細胞和肥大細胞均可表達[22]，AGEs即高級糖基化終產物，是RAGE的配體，由蛋白質與糖的糖基化而形成的[23]，RAGE參與激活促炎反應和各種炎癥基因有關的關鍵信號通路。一方面，AGEs通過激活包括軟骨細胞在內的各種細胞的核因子(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)來誘導炎癥[24]。另一方面，AGEs可能通過MAPK途徑增加PGE2和NO水平，增強OA軟骨細胞的炎癥反應[25]。腫瘤壞死因子(TNF)超家族在免疫、炎癥和控制細胞分化、增殖和凋亡中起著關鍵作用[26]。在OA患者中，滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中的TNF水平均升高，現有研究表明，TNF可抑制軟骨細胞中蛋白多糖、連接蛋白和Ⅱ型膠原的合成，刺激MMP-1、MMP-3和MMP-13，28的釋放，誘導IL-6和趨化因子的產生[6,27]。

圖8 KEGG功能富集分析柱狀圖

通過以上分析，我們團隊認為，溫腎宣痹湯治療KOA主要是通過通過AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路，作用于IL-6、AKT1、VEGFA等核心靶點，發揮控制炎癥反應、調節免疫功能、抵抗氧化應激等作用，從而控制疾病的發生發展，體現了多系統、多靶點、多方向的特點，這符合中醫學整體與系統論治的觀念。未來還需進一步進行嚴謹細致的實驗，以研究溫腎宣痹湯治療OA的確切分子作用機制。