基于MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的過氧化氫比色檢測

崔 夢 雨,黨 雪 明,趙 慧 敏

(大連理工大學 環境學院 工業生態與環境工程教育部重點實驗室， 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

過氧化氫(H2O2)具有強氧化性，常作為漂白劑、消毒殺菌劑、脫氯劑等，被廣泛應用于化學工業、醫療、食品工程等領域．但是日常生活中H2O2過度使用的現象嚴重，殘留的H2O2以氣體、液體形式擴散，通過呼吸、吞食和皮膚接觸等途徑侵入人體后，易轉化為羥基自由基(·OH)，造成細胞膜的破壞、血清蛋白酶失活和細胞變異，與多種病變的發生有著密切的關系[1-2]．因此實現水體中H2O2的快速、簡便和靈敏檢測具有重要意義．

比色傳感法檢測H2O2具有操作簡便和檢測快速等優勢，主要是通過過氧化物酶催化H2O2氧化底物顯色從而實現H2O2的檢測[3]．但天然酶(如辣根過氧化物酶，HRP)的活性易受酸堿度、溫度、鹽度等環境因素影響，導致其結構構象發生改變，進而失去催化活性[4]．為解決該問題，研究者設計并制備了具有過氧化物酶活性的納米酶，通過結構設計與納米材料復合等方式提高催化活性，為H2O2的靈敏檢測提供了新的發展思路[5-6]．據報道，具有納米片層結構的二硫化鉬(MoS2)展現了較好的類過氧化物酶活性[7-9]，但表面催化位點較少限制了其在H2O2靈敏檢測中的進一步應用[10-11]．Fe3O4作為一種良好的H2O2催化劑，將其修飾于MoS2納米片表面可以增加催化活性位點，提高H2O2催化性能[12]．同時，二維MoS2納米材料在離子鍵、金屬鍵和分子間作用力等非共價鍵作用下容易發生相互堆疊，導致大量的活性位點不能參與H2O2催化過程．作為一種具有三維網狀結構的聚合物材料，水凝膠由單體和交聯劑通過化學作用(共價偶聯)和物理作用(疏水和靜電)聚合而成，水凝膠三維結構的引入可增加MoS2片層之間的間距，暴露更多的活性位點[13]，構建具有三維結構的MoS2類過氧化物酶體系，可以進一步提高催化活性．為此，本文制備MoS2-Fe3O4復合物水凝膠，并構建比色傳感平臺實現水體中H2O2的靈敏檢測．

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

(1)實驗試劑

二硫化鉬(MoS2，分析純，>98%)、牛血清蛋白(BSA，分析純，>98%)、海藻酸鈉((C6H7O6Na)n，分析純，90%)、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB，分析純，>99%)和四氧化三鐵納米顆粒(Fe3O4NPs，≤30 nm，分析純，>98%)購買于上海阿拉丁生化科技有限公司；其余藥品氯化鐵(FeCl3，分析純)、氯化亞鐵(FeCl2·4H2O，分析純)、冰乙酸(CH3COOH，分析純，99.5%)、乙酸鈉(CH3COONa，分析純，98%)、過氧化氫(H2O2，分析純，30%)、無水乙醇(CH3CH2OH，分析純，99%)購于國藥集團化學試劑有限公司．

(2)實驗儀器

采用掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S-4800，日本株式會社日立制作所)對所制備的MoS2納米片及MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的微觀形貌進行表征，通過X-射線能譜分析(EDS)觀察MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的元素分布；通過透射電子顯微鏡(TEM，Hitachi S-4800，日本株式會社日立制作所)觀察MoS2納米片的微觀形貌；通過X射線衍射儀(XRD，LabX XRD-6000，日本株式會社島津制作所)進行MoS2納米片及MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的晶體結構分析；通過X射線光電子能譜分析儀(XPS，ESCALAB 250Xi，美國Thermo Fisher公司)分析MoS2-Fe3O4復合物水凝膠材料的元素價態．

1.2 MoS2納米片的制備

本實驗采用超聲剝離法制備MoS2納米片[14-16]，主要過程如下：首先，在室溫條件下制備牛血清蛋白水溶液(BSA，1 mg/mL)．然后將塊狀的MoS2粉末分散于牛血清蛋白水溶液中，MoS2與牛血清蛋白的質量比為5∶1，超聲處理24～48 h；隨后在3 000 r/min條件下低速離心2 min去除未剝離的塊狀材料，收集灰綠色的上層懸浮液，再在13 000 r/min條件下高速離心10 min，分離上清液中的牛血清蛋白，底部沉淀用去離子水重復洗滌5次．最后，通過真空冷凍干燥得到薄層MoS2納米片．

1.3 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的制備

使用化學共沉淀工藝合成了MoS2-Fe3O4復合物水凝膠，實驗在室溫以及pH=6條件下進行，方法易于操作[17-19]．具體的實驗方案如下：首先制備Fe2+/Fe3+混合溶液，將1.363 g FeCl3和0.835 g FeCl2·4H2O溶于50 mL去離子水，該溶液用作MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的交聯劑．為考察不同含量MoS2納米片基水凝膠的類過氧化物酶活性，分別將1、5、10 mg的MoS2納米片與質量分數為1%的海藻酸鈉溶液磁力攪拌1 h得到1、5、10 mg/mL的MoS2-海藻酸鈉混合溶液．將不同混合比例的MoS2-海藻酸鈉混合溶液滴入Fe2+/Fe3+混合溶液中后，60 ℃靜置 30 min，得到黑色的MoS2-Fe3O4復合物水凝膠顆粒，冷凍干燥后研磨為粉末備用．相同實驗條件下，不添加MoS2納米片制備了Fe3O4水凝膠：將質量分數為1%的海藻酸鈉溶液滴加到Fe2+/Fe3+混合溶液(與MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的交聯劑相同)，60 ℃靜置30 min，得到Fe3O4水凝膠顆粒，冷凍干燥后研磨為粉末備用．MoS2-Fe3O4納米顆粒(MoS2-Fe3O4NPs)的制備：將MoS2納米片與Fe3O4納米顆粒物理混合、研磨均勻后備用．

1.4 水體中H2O2的檢測

MoS2-Fe3O4復合物水凝膠具有高類過氧化物酶活性是基于Fe3O4和MoS2具有協同的催化作用，且水凝膠三維結構的構建使更多的催化位點暴露，促進含氧自由基的產生，有利于氧化底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)形成藍色產物，進一步提高反應體系的催化性能．通過構建比色傳感平臺可以實現水中H2O2的比色檢測(檢測過程如圖1所示)．

圖1 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的H2O2檢測 示意圖Fig.1 Schematic illustration of MoS2-Fe3O4 composite hydrogel detect for H2O2

為得到最佳的檢測效果，對顯色反應的時間(3、5、10、30、40、60、75、90 min)、緩沖液pH(3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、7.2、7.8)、反應溫度(25、30、35、45、55、65 ℃)、TMB濃度(0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、12.5、17.5 mmol/L)進行優化．通過優化實驗得到最佳檢測條件后，進行水體中的H2O2檢測．檢測過程為將960 μL的乙酸-乙酸鈉(0.2 mol/L，pH=4.0)緩沖溶液，加入20 μL的MoS2-Fe3O4復合物水凝膠溶液(0.1 mg/mL)，與60 μL TMB(10 mmol/L)和60 μL 不同濃度的H2O2溶液(1～2.5 mmol/L)均勻混合，混合溶液在35 ℃下反應40 min，隨后轉移到石英比色皿中，測量體系在652 nm處的吸光度．若無特別注明，后續實驗均在該實驗條件下進行．

1.5 實際水體中H2O2的比色傳感檢測

為探索MoS2-Fe3O4復合物水凝膠在實際水體中的應用性能，進行實驗室自來水、西山水庫(中國，大連)和渤海沿海岸(中國，大連)等實際水體中H2O2的檢測．其中水庫水樣和海水水樣先用0.2 μm孔徑的濾膜過濾去除微生物細胞和懸浮顆粒雜質．隨后將自來水、預處理過的湖水和海水作為溶劑，分別制備H2O2濃度為10、50、150 μmol/L的加標樣品，后續實驗按照1.4中的步驟進行．

2 結果與討論

2.1 MoS2納米片和MoS2-Fe3O4復合物水凝膠形貌表征

通過電鏡觀察MoS2納米片及MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的微觀形貌．如圖2(a)、(b)所示，超聲剝離法制備的MoS2納米片具有薄的片層結構[20]．圖2(c)顯示MoS2-Fe3O4復合物水凝膠具有三維結構，并且Fe3O4納米顆粒原位生長在MoS2納米片表面．通過EDS進一步觀察復合材料的元素分布，如圖3所示，S、Mo、Fe、O元素的重疊部分與Fe3O4和MoS2位置(圖2(c))一致，說明MoS2-Fe3O4復合物水凝膠制備過程中Fe3O4成功修飾在MoS2表面．

(a) MoS2納米片SEM圖

(b) MoS2納米片TEM圖

(c) MoS2-Fe3O4復合物水凝膠SEM圖

圖4為MoS2納米片及MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的X射線衍射圖．在MoS2納米片的譜圖中，觀察到14.38°、32.68°、39.54°、49.79°、58.34°等特征峰，分別對應于MoS2納米片的(002)、(100)、(103)、(105)、(110)晶面(PDF#37-1492)[21]，表明經過超聲剝離后的MoS2納米片具有六邊形對稱晶型結構．如圖4所示，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的譜圖中，觀察到MoS2納米片的特征峰，表明復合物中MoS2納米片無明顯的晶型變化．另外，32.86°、38.27°、45.19°、55.22°、65.86°特征峰分別對應Fe3O4的(222)、(400)、(332)、(440)、(622)晶面(PDF#39-0238)[22]，表明Fe2+/Fe3+組分在MoS2-Fe3O4復合物水凝膠制備過程中轉化為Fe3O4．

圖3 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的EDS元素分布Fig.3 EDS element distribution of MoS2-Fe3O4 composite hydrogel

圖4 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠和MoS2納米片 的XRD譜圖Fig.4 XRD pattern of MoS2-Fe3O4 composite hydrogel and MoS2 nanosheets

通過X射線光電子能譜(XPS)進一步分析MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的元素組成和價態．圖5(a)中MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的全譜圖顯示了C、O、Fe、S、Mo元素的存在．圖5(b)、(c)、(d)顯示了S、Mo和Fe元素的高分辨率XPS．如圖5(b)所示S2p的XPS，在165.3 eV和162.5 eV處的特征峰對應于S2-的S2p1/2和S2p3/2軌道[23]．圖5(c)中Mo元素的高分辨率XPS在232.2 eV和229.1 eV處顯示兩個特征峰，分別對應于Mo4+的Mo3d3/2和Mo3d5/2，同時在235.7 eV處觀察到較低強度的特征峰對應于Mo6+的Mo2d3/2．圖5(d)中Fe2p的相關圖譜顯示，在727.2 eV和724.4 eV處的特征峰對應于Fe2p1/2，在714.2 eV和711.1 eV處的特征峰與Fe2p3/2相關，表明MoS2-Fe3O4復合物水凝膠包含Fe2+和Fe3+兩種氧化態[24]．

2.2 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠類過氧化物酶活性研究

本實驗采用典型的TMB-H2O2顯色反應體系，來研究MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的類過氧化物酶活性．從圖6觀察到，當反應體系為TMB和H2O2時，652 nm處的吸光度沒有發生變化，說明沒有發生氧化反應；當反應體系中加入MoS2-Fe3O4復合物水凝膠時吸光度顯著提高，表明其具有類過氧化物酶活性．在催化H2O2-TMB顯色反應中，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠相較于MoS2納米片和Fe3O4納米顆粒表現出更高的類過氧化物酶活性，說明MoS2與Fe3O4協同催化作用有利于提高催化活性，這歸因于Mo4+/Mo6+和Fe3+/Fe2+相互促進轉化的機制[24]，如以下反應式所示：

(a) 全譜

(b) S2p

(c) Mo3d

(d) Fe2p

Mo4++H2O2→Mo6++OH-+·OH

(1)

Mo4++Fe3+→Fe2++Mo6+

(2)

Mo6++H2O2→Mo4++H2O+O2

(3)

Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH

(4)

Fe3++H2O2→Fe2++H++HOO·

(5)

圖6 不同比色反應體系的吸光度譜圖Fig.6 The absorbance spectra of different colorimetric reaction systems

Mo4+/Mo6+與Fe2+/Fe3+可以催化H2O2產生·OH和HOO·，且體系中的Mo4+與Fe3+反應促進了Mo4+/Mo6+和Fe3+/Fe2+之間的價態轉化(式(2))，從而提高了催化H2O2的反應速率．同時，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠比MoS2-Fe3O4納米顆粒和Fe3O4水凝膠表現出更高的類過氧化物酶活性，這是由于構建三維水凝膠結構暴露了更多的催化位點，進一步提高了類過氧化物酶活性．

2.3 H2O2檢測條件的優化

對反應時間、TMB濃度、反應溫度、緩沖液pH進行優化．如圖7(a)所示，反應時間在3～40 min，顯色底物TMB的吸收峰強度隨時間增加而增大，在40 min后無明顯變化，因此選用40 min 為最佳反應時間．圖7(b)顯示吸光度隨TMB濃度(0.05～17.5 mmol/L)的增加而增大，在10 mmol/L后無明顯變化，因此選用10 mmol/L 進行后續實驗．從圖7(c)可以看出，當反應溫度從25 ℃上升至55 ℃，吸收峰強度隨溫度升高而增大，反應溫度高于55 ℃后有所下降．其中吸光度在25～35 ℃增加0.06，而在35～55 ℃增加0.03，變化幅度不明顯．研究表明HRP在35 ℃下具有最佳的催化活性[25]，而本文設計的MoS2-Fe3O4復合物水凝膠是模擬HRP的納米酶，當溫度高于35 ℃繼續升溫時，材料的催化活性提高不明顯，因此在35 ℃下進行H2O2的比色檢測．圖7(d)顯示當反應體系pH為4.0，吸收峰強度最大．因此實驗的最佳檢測條件：反應時間為40 min，TMB濃度為10 mmol/L，反應溫度為35 ℃，pH為4.0．

(a) 反應時間

(b) TMB濃度

(c) 反應溫度

(d) pH

2.4 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠類過氧化物酶活性動力學分析

為進一步研究MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的催化機理，在最佳優化條件下以TMB和H2O2為底物分析了動力學常數．如圖8所示，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠催化TMB和H2O2在一定濃度范圍內遵循典型的Michaelis-Menten模型[26-27]．Michaelis-Menten方程如下：

v0=vmaxcs/(Km+cs)

(6)

式中：v0是初始反應速率，vmax是最大反應速率，cs是底物濃度，Km是Michaelis-Menten常數．通常，Km表示催化劑與底物的結合能力，Km越小意味著催化劑與底物的親和力越好．本文通過擬合方程計算最大反應速率(vmax)和Km．為了對比不同材料的催化活性，表1列舉了MoS2納米片、Fe3O4納米顆粒、HRP以及MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的Km和vmax的對比結果．對比發現，以TMB為底物時，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的vmax分別是MoS2納米片的2.4倍、SDS-MoS2納米顆粒的7.7倍、Fe3O4納米顆粒的7.2倍、HRP的1.2倍，而MoS2-Fe3O4復合物水凝膠與上述類過氧化物酶材料的Km相差不大，說明反應過程中MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的催化活性起主導作用，表明構建的MoS2-Fe3O4復合物水凝膠三維結構有效增加了催化位點的暴露，提高了類過氧化物酶活性．同時，以H2O2為底物時，MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的Km是Fe3O4納米顆粒的31.2%、是MoS2-Fe3O4納米顆粒的3.12%、是HRP的2.1%，vmax是MoS2納米片的3.0倍、Fe3O4納米顆粒的2.7倍、MoS2-Fe3O4納米顆粒的2.4倍、HRP的1.5倍，表明MoS2-Fe3O4復合物水凝膠與H2O2底物具有較好的結合能力，且在催化反應中MoS2和Fe3O4具有協同催化作用，從而提高了材料的催化性能．

(a) H2O2

(b) TMB

表1 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠與其他納米酶和HRP的動力學參數比較

2.5 MoS2-Fe3O4復合物水凝膠比色檢測H2O2

基于MoS2-Fe3O4復合物水凝膠材料良好的類過氧化物酶活性，將其設計為比色傳感平臺用于檢測水體中H2O2．如圖9所示，H2O2濃度在1～2 500 μmol/L，反應體系在652 nm處(oxTMB 的特征吸收峰)與吸光度呈現良好的正相關關系．內插圖為H2O2濃度與吸收峰強度的線性響應關系，擬合方程為A=0.16+0.002 3c(H2O2)，相關系數R2為0.992．對數據線性擬合得到，H2O2檢測的線性范圍為3.0～200 μmol/L，檢測限(LOD)為0.28 μmol/L(3δ/s)．進一步與已報道的基于MoS2-Fe3O4以及MoS2-Fe3O4納米顆粒的比色方法進行比較，發現本文構建的MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的檢測限(LOD)較低(表2)．

圖9 652 nm處隨H2O2濃度變化體系吸光 度曲線Fig.9 The absorbance curve at 652 nm as a function of concentration of H2O2

表2 不同類過氧化物納米酶的H2O2檢測性能對比Tab.2 Comparison of different peroxidase-like nanozymes for H2O2 detection

2.6 實際水體中H2O2的檢測

采用加標回收法測定自來水、湖水和海水中的H2O2，對該傳感方法在實際水環境中檢測H2O2的可行性進行評估．實際水樣經過前處理后，采用加標回收法進行檢測，3種水樣分別投加10、100、150 μmol/L的H2O2制備人工水樣．在最佳實驗條件下，對加標樣品進行測定．如表3所示，經過3次重復實驗，計算得到自來水和湖水的平均回收率在93.1%～98.2%，相對標準偏差值為0.4%～8.0%，達到了較好的H2O2檢測效果．另外，海水體系中10 μmol/L H2O2的回收率(81.0%)低于自來水的(98.0%)和湖水的(96.0%)，相對標準偏差(10.8%)高于自來水的(6.0%)和湖水的(8.0%)，這是由于海水基質較為復雜，含氧自由基與金屬離子存在競爭關系，從而影響H2O2的檢測效果[32]．

表3 實際水體中H2O2的檢測Tab.3 H2O2 detection in actual waters

3 結 語

本文采用化學共沉淀法制備了MoS2-Fe3O4復合物水凝膠，并通過SEM、TEM、EDS、XRD、XPS對材料的形貌結構和元素價態進行表征，證明MoS2-Fe3O4復合物水凝膠的成功制備．同時考察了該水凝膠材料的類過氧化物酶活性以及檢測條件對催化活性的影響，將其用于檢測水體中H2O2，線性范圍為3.0～200 μmol/L，檢測限為0.28 μmol/L．采用加標回收法對實際水體(自來水、湖水和海水)中的H2O2進行檢測，回收率為81.0%～98.2%，相對標準偏差值為0.4%～10.8%，具有檢測不同類型實際水體中H2O2的應用潛力．