育幼經歷對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量的影響

張曉卉， 張名岳, 2*， 張萍， 黃祥明, 2， 吳孔菊, 2， 蘭景超, 2， 侯蓉, 2(. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都6008；2. 四川省大熊貓科學研究院，成都6008)

雖然以圈養為模式的大熊貓遷地保護繁育計劃基本實現了圈養大熊貓種群數量以及遺傳多樣性的自我維持(Xie，2016)，但從福利角度看其圈養模式存在一定弊端，如生存環境固定單一和空間狹小、育幼期過早的母子分離、飼喂時間固化以及刺激缺乏等，這些模式導致對大熊貓必需行為的剝奪、本能行為表達的抑制和異常行為表現的增加(Liu.，2003；張志和，魏輔文，2006)，影響大熊貓正常行為的充分表達。圈養大熊貓暴露的一些生產上的實際問題(如自然繁殖能力差)始終沒有得到解決(Swaisgood.，2003，2006)，嚴重影響了圈養大熊貓野外放歸計劃的實施，不符合科學繁育、健康飼養的大熊貓遷地保護國家戰略。造成這些問題的原因極有可能與圈養生活環境不能夠滿足大熊貓對各種生理需求(包括對配偶以及環境舒適度的需求)的自由選擇，擇偶和交配等自然本能行為不能夠充分表達或被抑制有關(Zhang.，2004；Martin-Wintle.，2015，2018，2020)。

育幼期是動物身體發育，包括神經發育、肌肉骨骼發育的關鍵時期，缺乏足夠的新鮮刺激，會影響神經發育(Hall，1998；Latham & Mason，2008)。圈養人工育幼環境單調、狹小以及多種非自然應激源的干擾(游客噪音、更換獸舍以及非自然的多種氣味等)，會給育幼期母獸造成壓力，導致撫育幼仔時不能為幼仔提供更多的學習和鍛煉機會，同時，也在一定程度上對育幼期的幼仔造成應激，限制了幼仔公獸先天性本能的激發和發育，最終可能會導致圈養大熊貓自然行為的喪失(Zhu.，2001；Garshelis，2004)。與育幼期近自然的全母乳育幼方式相比，非自然的人工輔助育幼方式會造成圈養成年大熊貓刻板行為的頻繁發生(Zhang.，2021)，同時，育幼期不同的育幼方式(全母乳近自然育幼vs.人工輔助育幼)會顯著影響雄性大熊貓幼仔成年后的自然交配行為的表達以及繁殖效率(Zhang.，2021)。由此推測，育幼早期(幼仔0～4月齡)采取接近自然的育幼方式以及成長環境對大熊貓幼仔自然行為(尤其是自然交配行為)的表達非常重要。

目前，對于育幼期圈養大熊貓的應激方面以及育幼經歷對幼仔行為發育影響方面的研究較少，集中在母獸育幼行為表達的環境影響因素方面(Zhang.，2000；Snyder.，2016；Heiderer.，2018)。雖然中國大熊貓保護研究中心以及奧地利維也納動物園等都曾經嘗試為臨產大熊貓修建人工育幼巢穴，使其像野生大熊貓一樣進行自然的育幼，但這對于幼仔的行為發育以及成年后的自然交配能力是否有影響卻沒有報道(Snyder.，2003；Li.，2017)。Heiderer等(2018)首次介紹了奧地利動物園利用人工育幼巢穴成功育幼大熊貓雙胞胎的案例，重點介紹了育幼期雙胞胎與母獸的行為情況；Snyder等(2016)對圈養大熊貓育幼期母獸及幼仔的行為作了比較全面的描述，并得到了經產母獸比初產母獸有更好育幼行為的結果；雖然Snyder等(2003)的研究結果顯示，母子分離對雄性和雌性幼仔行為的影響不同，且同伴養育不能給幼仔提供與母獸養育相同水平的社會刺激，但此實驗沒有研究母子分離對成年大熊貓福利的影響。同時，圈養環境中多種非自然應激源(游客噪音、更換獸舍以及非自然的多種氣味等)，也是造成圈養大熊貓心理應激的重要因素。飼養模式對大熊貓行為以及生理免疫方面影響的研究集中在環境豐容(活動空間、環境豐富度等)和物件豐容(新奇事物刺激)對圈養大熊貓刻板行為、行為多樣性以及活動節律等方面(Liu.，2003；Swaisgood.，2005；Liu.，2006；Liu.，2017)。目前能夠反映圈養大熊貓應激水平的激素類指標并不多，最具代表性的為糞便和尿液中皮質醇的含量(Owen.，2004；Liu.，2006)。

因此，在前期研究的基礎上，本研究旨在探討育幼期不同的育幼模式對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量的影響，了解圈養育幼模式可能引發成年雌性大熊貓的應激問題，為完善育幼期圈養大熊貓圈舍的設計，以及提高圈養大熊貓的福利水平提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇成都大熊貓繁育研究基地9只育幼期成年雌性大熊貓為研究對象，分為3組，每組3只：第一組是母獸生育單胎幼仔，采取全母乳育幼的方式；第二組是母獸生育單胎幼仔，采取母獸和人工交替的常規人工輔助育幼的方式；第三組是母獸生育雙胎幼仔，采取母獸和人工交替的常規人工輔助育幼的方式。

1.2 育幼期的管理

幼仔1.5～2歲自然斷奶前，與母獸共同生活在育幼期圈舍內，待幼仔可以走動后，讓其與母獸隨意選擇圈舍內、圈舍外出入。斷奶后采取逐步分離母子的方式，減少分離產生的應激。

無論是全母乳育幼還是常規人工輔助育幼，前期(幼仔0～3月齡)均在圈舍中進行。單胎全母乳的育幼方式中幼仔主要與母獸一起飼養，母獸與幼仔分離的機會少、時間短(幼仔每次離開母獸進行體檢或人工補奶的時間不超過2 min，整個育幼前期幼仔離開母獸的總時間不超過180 min)。為保證幼仔的健康，獸舍兩側增加了2扇推拉門，幼仔發生突發情況時可透過圈舍欄桿開門取出。常規人工輔助育幼的方式中幼仔主要在保溫箱中生活，與母獸經常分離。

1.3 不同的育幼方式和經驗對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量的影響

收集育幼期第1周、第4周、第8周和第12周(每周3 d)成年雌性大熊貓的晨尿樣品(07∶00—09∶00)，-20 ℃保存。所有尿液樣本均從堅實、清潔的地板上吸出，不與糞便或水接觸，避免交叉污染和稀釋。

利用ELISA方法檢測尿液皮質醇含量。相關試劑、標準品和稀釋液的配制方法與步驟按照Cayman的尿液Cortisol ELISA Kit 試劑盒的要求進行。

標準品制備：準備6支干凈試管，分別標號100、50、25、12.5、6.25和0。用肌酐標準品原液(100 μg·mL，4 ℃保存)和TRIZMA Buffer進行2倍稀釋：向標號100的試管加入400 μL肌酐標準品原液，室溫放置恢復至常溫，渦旋充分混勻，標號0～50的試管分別加入 200 μL TRIZMA Buffer，從標號100的試管吸取 200 μL 肌酐標準品原液至標號50的試管，充分渦旋混勻；再從標號50的試管吸取200μL肌酐標準品稀釋液至標號25的試管，充分渦旋混勻；再從標號25的試管吸取200 μL肌酐標準品稀釋液至標號12.5的試管，充分渦旋混勻；再從標號12.5的試管吸取200 μL肌酐標準品稀釋液至標號6.25的試管，充分渦旋混勻。

1)加樣：取干凈的96孔酶標板標記肌酐字樣，向前4個孔分別加入50 μL配好的肌酐標準品(0～100，每個稀釋度加2個孔)，從第5個孔開始，每個孔加入待測尿樣稀釋液50 μL(每個稀釋度加2個孔)；每個孔用排槍隔空分別依次加入50 μL ddHO，50 μL 0.75N NaOH，50 μL 0.4 N苦味酸；輕晃酶標板，室溫放置15 min后讀數。

2)讀板：492 nm波長下讀數。

A=肌酐含量(mg·mL)=[肌酐(μg·mL)×稀釋倍數]/1 000；B=皮質醇含量(pg·mL)=每孔皮質醇含量(pg/well)×稀釋倍數；C=肌酐矯正皮質醇含量(cortisol ng/mg Cr)=B/A/1 000。

1.4 數據統計

2 結果與分析

生理指標結果表明，育幼早期(前8周)的育幼時間和育幼方式均對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量有顯著影響(育幼時間：=165.682，<0.01；育幼方式：=75.091，<0.01)，其中，隨著幼仔年齡增長，圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量顯著增加；在育幼期第1、4和8周，人工輔助育幼組母獸的尿液皮質醇含量顯著高于全母乳育幼單胎組；育幼方式與育幼時間之間的交互作用明顯(=3.841，<0.01；圖1)。

圖1 育幼期不同的育幼方式和時間對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量的影響Fig. 1 Effects of different nursing methods and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period

**<0.01；下同the same below

育幼早期(前12周)的育幼時間和育幼經驗對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量均有顯著的影響(育幼時間：=91.531，<0.01；育幼經驗：=58.305，<0.01)，其中，育幼期第4周和第12周，經產成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量均顯著低于初產；另外，隨著幼仔年齡增長，圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量均顯著增加；但育幼經驗與育幼時間之間的交互作用不明顯(=1.940，=0.151；圖2)。

圖2 育幼期不同的育幼經驗和時間對圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量的影響Fig. 2 Effects of different nursing experience and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period

3 討論

本研究發現，育幼期前12周，采取人工輔助育幼方式的成年雌性大熊貓尿液皮質醇的含量顯著高于采取全母乳育幼方式，這表明，人工輔助育幼的方式對育幼期圈養成年雌性大熊貓產生了應激，這也補充了我們前期的行為學研究結果：人工輔助的育幼方式減少了育幼期母獸與幼仔在一起的時間，導致母獸在與幼仔分離后產生頻繁的踱步以及針對欄桿祈求幼仔等刻板行為(Zhang.，2021)。動物福利學者認為，刻板行為的出現可能標志著動物對生存環境的不適應以及正在遭受心理痛苦(Broom，1986)。除了行為表現外，激素水平也在一定程度上反映了圈養大熊貓存在心理不適的問題。前人研究發現，不利環境因素(噪音等)會造成圈養大熊貓糞便和尿液皮質醇水平顯著升高(Owen.，2004；Liu.，2006；Powell.，2006)。大量人類臨床研究證實，慢性心理應激與下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能紊亂有關，而皮質醇正是調節該軸功能的重要激素，即過量的皮質醇水平預示著心理不適的存在(Sapolsky.，2000)。在幼仔離開后，母獸心理受到了嚴重的創傷，而這可能與育幼前期母獸的母性行為被激發但表達受到人為抑制有關。Latham和Mason(2008)的報道也已經證實了育幼期過早的母子分離會促進幼仔刻板行為的發育，而本實驗做了很好的補充，證明了育幼期長時間的母子分離也會導致母獸尿液皮質醇含量的顯著上升。

本實驗還發現，有育幼經驗的經產圈養成年雌性大熊貓尿液皮質醇含量顯著低于沒有育幼經驗的初產母獸，這說明，經產的圈養母獸在育幼前期的應激水平低于初產的母獸，也從側面說明具有育幼經驗的經產母獸對環境的適應性更強，這可能與經驗效應有關。前期對妊娠期母豬的研究結果也發現，有妊娠期限位經驗的母豬要比初次經歷限位飼養的表現出更少的刻板行為以及應激相關的血液皮質醇、IgA和IL-6含量更低，這說明不利的經驗效應可以緩解動物的應激水平，使其更容易適應不利的生存環境(Zhang.，2017)。同時，育幼前期不同的育幼環境應激是否對幼仔的行為發育(尤其是自然交配行為的表達)以及性格等情緒認知方面有影響還不清楚(Zhang.，2017)，有待后期繼續深入的研究。

由于每年圈養大熊貓繁育數量有限，試驗樣本量較小，在統計分析中有可能出現假顯性現象，希望后期積累新的圈養大熊貓育幼數據以驗證本試驗的結論。

本實驗發現，與全母乳育幼方式相比，人工輔助育幼的方式會使圈養成年雌性大熊貓尿液中皮質醇的含量顯著升高，造成嚴重的心理焦慮。因此，在圈養環境下，采取全母乳育幼的方式是符合大熊貓自然育幼特點且有利于母獸福利的育幼方式。

感謝給予本研究幫助的成都大熊貓繁育研究基地的大熊貓飼養員和工作人員。