阿糖胞苷對人急性髓系白血病細胞活力、凋亡的作用及機制*

彭煜暉，梁欣明，付文莉，喻艷琴，段娟娟，吳昌學*，張啟芳*

(貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種由髓系造血祖細胞異常增殖和分化引起的高度異質性的惡性克隆性疾病，可繼發于腫瘤相關疾病的化療、放療，或者是由其他血液相關疾病轉化而來，患者都具有不同分析遺傳學的異常，這與AML的發生發展密切相關[1]；通過骨髓細胞的異常增殖和分化，浸潤到血液、骨髓血和其他組織中，導致造血功能受損和各種并發癥[2-3]。對于大多數類型急性白血病，化療仍是主要的治療手段。化療藥物大多通過誘導腫瘤細胞凋亡而發揮抗腫瘤的作用[4]。阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)是白血病治療中最為經典的藥物之一，能夠誘導人白血病細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，至今急性白血病的大部分治療方案仍以其為基本組成[5-6]。Ara-C進入人體后會轉化和Ara-C三磷酸，對DNA合成進行抑制，是一種S期特異性藥物[7]；并且Ara-C能夠誘導HL-60細胞凋亡，還可伴c-Myc、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)基因的下調[8]。c-Myc作為最為普遍的致癌轉錄因子之一，廣泛參與多種癌癥的發生發展過程并且在多種腫瘤中異常表達，c-Myc與侵襲性疾病和不良預后有關，其高表達能增強腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡和分化失調[9-11]。在套細胞淋巴瘤 Jeko-1 細胞株中沉默c-Myc，對細胞的增殖分化活性有明顯的抑制[12]；更重要的是，幾乎所有AML細胞的增殖和存活都依賴于c-Myc[13]；抑制c-Myc基因能夠阻止白血病的發生和白血病細胞的增殖和存活[14-15]。因此，c-Myc常作為抗白血病治療的關鍵分子靶點[16]。由于c-Myc沒有酶的活性位點，其抑制劑治療白血病效果較差、且尚未取得成功[13]。因此，c-Myc靶基因的確定在治療白血病尤為重要。由于Ara-C在AML中作用機制的尚未闡明，導致耐藥和復發成為治療的難題，本研究探討Ara-C對AML細胞MV4-11的細胞活力、凋亡和HMGB1/c-Myc表達的影響及作用機制，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 人AML細胞MV4-11為地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室所保留。

1.1.2主要試劑與儀器 lscove's DMEM培養基(美國CORNING)，澳洲胎牛清(美國Gibco)，Ara-C(美國SIGMA-ALDRICH)，兔抗單克隆抗體c-Myc、高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)和過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記抗兔的二抗(美國CST)，超敏華軒發光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Millipore)，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白三色Marker(美國Thermo)，抗體稀釋液、5%脫脂奶粉封閉液、十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒(中國碧云天)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma)；GeneGnome XRO NPC化學發光成像儀(英國SYNGENE)，Varioskan LUX 多通道酶標儀(美國 Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ垂直電泳儀和Bio-Rad powerpacHC高流電源(美國 Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養與細胞活力檢測 將人AML細胞MV4-11置于10%胎牛血清和1% Antibiotic-Antimycotic的lscove’s DMEM培養基，5%CO2的37 ℃培養箱中培養；取對數生長MV4-11細胞并調整細胞懸液濃度為1×104個/孔，接種于96孔板中；使用DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理(DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L組)，按照細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK8)說明書要求，分別于24、48和72 h檢測450 nm波長處的光密度(optical density，OD)值。

1.2.2細胞凋亡實驗 分別用DMSO、Ara-C處理人AML細胞MV4-11細胞，Ara-C終濃度為0.5、1.0及1.5 μmol/L，于37 ℃的5%CO2培養箱中孵育48 h，收集細胞；利用Annexin V/PI雙染法凋亡試劑盒檢測Ara-C對MV4-11細胞凋亡的影響；將樣本上流式細胞儀檢測，以DMSO組作為空白對照，用FlowJo V10軟件(treestar)分析數據。

1.2.3蛋白印跡(Western blot)法檢測Caspase 3、c-Myc及HMGB1蛋白表達 取對數生長期人AML細胞MV4-11細胞作為空白組，1.0 μmol/L Ara-C處理對數生長期的人AML細胞MV4-11細胞3、6、12、24及48 h；收集各組細胞，提取總蛋白，蛋白上樣20 μg，80 V恒壓電泳并轉膜至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，室溫分別孵育Caspase3一抗(1∶1 000)、c-Myc一抗(1∶1 000)及HMGB1一抗(1∶1 000)2 h，然后室溫孵育抗兔二抗(1∶1 000)1 h，ECL超敏化學發光液檢測Caspase 3、c-Myc及HMGB1蛋白的表達，并利用Image J分析圖像強度。

1.2.4c-Myc與AML患者預后 利用cBioportal(http://www.cbioportal.org/)在線分析工具下載Acute Myeloid Leukemia(OHSU，Nature 2018)數據；利用R包(survminer)將341個樣本分c-Myc高表達組(n=231)和c-Myc低表達組(n=110)，分析c-Myc與AML患者生存期的相關性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞活力

使用DMSO、0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理MV4-11細胞24、48及72 h后，CCK8試劑盒檢測Ara-C對細胞活力的影響，結果表明，與DMSO組相比，各組MV4-11細胞不同時間的活力均降低，且具有濃度依賴性(P<0.000 1)。見圖1。

注：與DMSO組比較，(1)P<0.000 1。

2.2 細胞凋亡

0.5、1.0及1.5 μmol/L Ara-C處理MV4-11細胞48 h，流式細胞儀檢測結果顯示，與DMSO組相比，隨著Ara-C濃度的增加，凋亡細胞所占的比例明顯升高，且具有濃度依賴性(P<0.05)，表明Ara-C能誘導MV4-11細胞的凋亡。見圖2。

注：A、B分別為流式細胞儀檢測結果和細胞凋亡定量結果；(1)與DMSO組相比，P<0.001。

2.3 Caspase 3蛋白表達

1.0 μmol/L Ara-C處理3、6、12、24及48 h后，蛋白印跡檢測Caspase 3的蛋白表達水平，結果顯示，與DMSO組相比，1.0 μmol/L Ara-C處理后Caspase 3表達水平降低，且具有時間依賴(P<0.05)，提示Ara-C處理MV4-11細胞后能夠使Caspase3活化，從而促進細胞凋亡。見圖3。

注：A、B分別為檢測Caspase 3結果和蛋白定量結果；與DMSO組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05，(3)P<0.001，(4)P<0.000 1。

2.4 c-Myc表達對AML患者生存的影響

使用cBioportal數據庫下載Acute Myeloid Leukemia(OHSU，Nature 2018)數據，分析c-Myc對AML患者生存的影響。結果表明，c-Myc高表達與AML患者較差生存期呈正相關(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同c-Myc表達對AML患者生存的影響

2.5 c-Myc和HMGB1蛋白表達

Western blot結果表明，與空白組相比，1 μmol/L Ara-C處理MV4-11細胞3、6、12、24及48 h 后HMGB1和c-Myc的蛋白表達水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為HMGB1和c-Myc蛋白表達；B、C分別為c-Myc和HMGB1定量結果；與空白組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.001，(3)P<0.000 1，(4)P<0.05。

3 討論

AML屬于血液系統的惡性腫瘤，主要特征為發病快、病情進展迅速、控制難、易復發、預后差及發病率隨著年齡的增加而上升[17-18]。因AML發病原因尚不明確，如不及時進行治療，患者生存期較短[19]。目前，對于AML治療主要以化療為主，而Ara-C是AML鞏固治療中使用頻率較高的藥物[20]。本研究旨在探索Ara-C誘導MV4-11細胞凋亡、抑制細胞活力的分子機制研究。研究結果表明，與DMSO組相比，隨著Ara-C濃度的增加，MV4-11細胞的活力被抑制及凋亡數量增加(P<0.05)，表明Ara-C能夠抑制細胞活力和誘導MV4-11細胞的凋亡，并且具有濃度依賴性；利用cBioportal數據庫下載數據進行分析，結果表明c-Myc與AML患者的總生存期呈正相關(P<0.05)，即c-Myc高表達與患者的不良預后相關；與DMSO組相比，Ara-C下調了HMGB1/c-Myc的蛋白表達水平(P<0.05)，進一步說明Ara-C誘導MV4-11細胞凋亡的分子機制。

Ara-C是一種用于細胞增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，通過抑制細胞DNA的合成，干擾細胞的增殖，并且能通過Caspase9誘導線粒體介導的細胞凋亡[21]。同樣，本研究結果表明Ara-C能夠抑制MV4-11細胞的活力及誘導細胞的凋亡(P<0.05)，且具有濃度依賴性(P<0.05)。

c-Myc能直接與基因啟動子區的E-box結合，調控多種基因的表達，參與細胞周期以及細胞生長、凋亡、分化和代謝等關鍵進程[22]。已有研究顯示，c-Myc過表達可促進原癌基因RAS突變引發膠質瘤生長[23]；敲低c-Myc能顯著抑制細胞增殖和腫瘤的生長[24]；白血病細胞異常生長和增殖與c-Myc的高表達呈正相關，并且患者較差預后[25]。這些研究與本研究結果一致，c-Myc高表達與AML患者的總生存期呈正相關(P<0.05)；Ara-C能抑制MV4-11細胞中c-Myc的蛋白表達水平且具有濃度依賴(P<0.05)。本課題組前期研究顯示，在去勢抵抗性前列腺癌中HMGB1與c-Myc的表達有一定相關性，即HMGB1對c-Myc表達具有正向調控作用[26]。也有研究結果顯示，c-Myc磷酸化水平會隨著HMGB1的表達變化而變化[27]；更重要的是HMGB1在白血病發病機制有著重要的作用，化療后白血病細胞能釋放HMGB1，從而抑制Bcl-2表達和Caspase3活性，最后對白血病細胞壞死性凋亡起著負調節作用[28-29]。在慢性粒細胞白血病中，敲低HMGB1能在G1期阻滯細胞周期，同時通過下調環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達來抑制細胞增殖[30]；在人高轉移肝癌細胞HCCLM3中，沉默HMGB1的表達能夠抑制c-Myc和磷酸化c-Myc的表達[27]；結直腸癌研究也表明，HMGB1可通過影響糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)/c-Myc通路，從而抑制細胞的遷移和侵襲能力[31]。這些研究結果與本研究一致，表明Ara-C能夠抑制MV4-11細胞HMGB1和c-Myc蛋白表達水平，從而誘導細胞凋亡和抑制細胞活力。

綜上，Ara-C可通過下調HMGB1/c-Myc的表達來抑制人AML細胞活力和誘導細胞凋亡，這為后續的研究工作提供一定的基礎，有望在體內實驗驗證本研究的假設。