對銀屑片微生物限度檢查方法適用性的試驗研究

黃 燕，徐麗波，袁 麗，戴余雯，劉銘佩，李待軍

（1. 蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000 ；2. 蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 ；3. 甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000）

銀屑片是蘭州大學第二醫院的院內制劑，由梔子、黃芪等9 味中藥組成，具有瀉火除煩、清熱涼血等功效，主要用于牛皮癬的治療，臨床療效顯著[1]。微生物污染是影響制劑質量和引發不良反應的重要因素之一。為了保證制劑質量，必須采用適宜的方法對其進行微生物限度檢查[2]。在本文中，筆者主要是分析采用文中所選微生物限度檢查方法對銀屑片進行微生物限度檢查的適用性。

1 材料與儀器

1.1 試驗樣品

銀屑片，100 片/ 瓶。

1.2 培養基及主要試劑

沙氏葡萄糖液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、腸道菌增菌液體培養基、RV 沙門菌增菌液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、麥康凱液體培養基、pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液。上述培養基均購自青島海博科技生物技術有限公司。

1.3 菌種

白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、乙型副傷寒沙門菌〔CMCC(B)50094〕、大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕、 枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B)44104〕、金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕，以上菌種均購自中國食品藥品檢驗研究院。

1.4 儀器

蘇州安泰BSC-1304 ⅡA2 型生物安全柜、上海躍進SPX-80B 型生化培養箱、麥克奧迪AE2000 型顯微鏡、上海三申YX280A 型壓力消毒器、梅特勒XSZ205 型電子天平。

2 微生物計數檢查方法適用性試驗

2.1 菌液制備

將各菌種均制成不同濃度的菌懸液。選用pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌分別制成濃度為104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌懸液，選用0.9% 的無菌氯化鈉溶液將白色念珠菌、黑曲霉菌分別制成濃度為104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 的菌懸液[3]。

2.2 供試液制備

取銀屑片10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液100 mL，制成1:10 供試液。取10 mL，加90 mL pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，制成1:100 供試液，備用。

2.3 微生物計數檢查

2.3.1 試驗組樣品的制備 1）平皿法樣品的制備：取7 份10 mL 的1:10 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），搖勻，取樣1 mL，傾注相應培養基。2）培養基稀釋法（1:10）樣品的制備：取7 份10 mL 的1:10 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），分別取樣0.2 mL、0.5 mL，傾注相應培養基。3）供試液稀釋法（1:100）樣品的制備：取5 份10 mL 的1:100 供試液，分別加0.1 mL 的“2.1”項下菌懸液（104 cfu/mL），取樣1 mL，傾注相應培養基[4-5]。

2.3.2 菌液對照樣品的制備 取相應量的“2.1”項下菌懸液（102cfu/mL）注皿，傾注相應培養基。

2.3.3 供試液對照樣品的制備 取相應量的“2.2”項下供試液注皿，其他操作同“2.3.1”。

2.3.4 陰性對照樣品的制備 取相應量的pH 7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液替代供試液，注皿，不加菌懸液，其他操作同“2.3.1”。

2.3.5 用不同微生物計數檢查方法對銀屑片進行微生物計數檢查適用性的比較 平皿法樣品中銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的回收比值均低于0.5。這表明，此微生物計數檢查方法不適用于對銀屑片進行需氧菌總數計數檢查及霉菌和酵母菌總數計數檢查[6-7]。培養基稀釋法（1:10，0.2 mL/ 皿）樣品中白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均高于0.5。這表明，此微生物計數檢查方法適用于對銀屑片進行霉菌和酵母菌總數計數檢查。供試液稀釋法（1:100，1 mL/ 皿）樣品中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌的回收比值均大于0.5。這表明，此微生物計數檢查方法適用于對銀屑片進行需氧菌總數計數檢查。詳見表1。

表1 用不同微生物計數檢查方法對銀屑片進行微生物計數檢查適用性的比較

2.4 用上述微生物計數檢查方法對銀屑片進行微生物計數檢查適用性的驗證

由表2 可知，采用供試液稀釋法（1:100，1 mL/皿）和培養基稀釋法（1:10，0.2 mL/ 皿）進行銀屑片加菌回收試驗時各種需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比值均在0.5 ～2.0 之間。這表明，采用上述微生物計數檢查方法對銀屑片進行需氧菌總數計數檢查及霉菌和酵母菌總數計數檢查的適用性良好。

表2 銀屑片加菌回收試驗的結果

3 控制菌檢查方法適用性試驗

3.1 試驗組樣品的制備

取銀屑片10 g，加胰酪大豆胨液體培養基100 mL、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌菌懸液各1 mL（102cfu/mL），然后進行培養、接種、觀察。

3.2 陽性對照樣品的制備

取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌菌懸液各1 mL（102cfu/mL），加胰酪大豆胨液體培養基100 mL，其余操作同上。

3.3 供試液對照樣品的制備

取1:10 供試液10 mL，加胰酪大豆胨液體培養基100 mL，不加菌懸液，其余操作同上。

3.4 陰性對照樣品的制備

取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，加胰酪大豆胨液體培養基100 mL，其余操作同上。

3.5 控制菌檢查方法適用性驗證試驗的結果

由表3 可知，試驗組樣品和陽性對照樣品中正常檢出了大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌，陰性對照樣品和供試液對照樣品中未檢出大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌。這表明，采用胰酪大豆胨液體培養基法（培養基稀釋體積為100 mL）對銀屑片進行控制菌檢查的適用性良好。

表3 用上述控制菌檢查方法對銀屑片進行控制菌檢查適用性驗證試驗的結果

4 討論

醫院制劑是臨床用藥不可或缺的一部分，長期以來，其因具有使用方便快捷、價格便宜、療效佳等優點，在臨床治療服務中發揮著極其重要的作用。由于醫院制劑只能在醫療機構內使用，生產規模較小、生產設備較簡單，導致制劑質量出現問題的風險較高[8-9]。進行微生物限度檢查是控制制劑質量的主要方法之一[10-11]。在為具有抑菌活性的中藥制劑選擇微生物限度檢查方法時，應依據《中國藥典》中的相關要求進行相應的適用性試驗，以確保其自身抑菌活性不會造成檢查結果的偏差[12-14]。本研究的結果顯示，用文中所選微生物限度檢查方法對銀屑片進行微生物限度檢查的適用性良好（即銀屑片自身的抑菌活性不會造成檢查結果的偏差）。綜上所述，文中所選微生物限度檢查方法可用于對銀屑片進行微生物限度檢查。