Moesin調(diào)控肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

張若琛 陳義坤 祝清清 張偉杰 黃建安

Moesin是ezrin-radixin-moesin (ERM)家族蛋白成員之一，它連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和跨膜受體。ERM在不同物種之間高度保守[1]，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，如微絨毛和膜皺褶，以及特殊的膜結(jié)構(gòu)域中起著關(guān)鍵作用[2-3]。ERM蛋白以單體或二聚體的形式存在于靜止?fàn)顟B(tài)，可以通過磷脂或激酶介導(dǎo)的磷酸化誘導(dǎo)的構(gòu)象變化來調(diào)節(jié)其功能，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的激活[4]。Moesin在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，包括乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胰腺[7]、肺癌[8]和黑色素瘤[9]，并且其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。

目前尚無關(guān)于Moesin對肺癌增殖轉(zhuǎn)移作用的研究。本文旨在探索Moesin在非小細(xì)胞肺癌中的作用及其機(jī)制。

資料與方法

一、一般材料

1 細(xì)胞株 從中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)采購人NSCLC細(xì)胞A549、SPC-A1、HCC827、PC9、H1975(肺腺癌細(xì)胞系)、H226(肺鱗癌細(xì)胞系)H460(大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)和BEAS-2B(人永生化正常上皮細(xì)胞)。

2 主要儀器 電泳儀(Bio-Rad)、顯微鏡(Olympus)、移液槍(Eppendorf)、超凈工作臺(中國蘇凈安泰公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、50 mL塑料培養(yǎng)瓶(Corning)、Transwell 小室(Corning)、24孔培養(yǎng)板(Corning)。

3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640(Hyclone)、胰酶(Cell Signal Technology)、無血清細(xì)胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司)、蛋白酶/磷酸酶抑制劑(Hyclone)、Anti-Moesin antibody(Abcam)、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為試劑生物科技有限公司)、結(jié)晶紫(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

4 RNA干擾序列 si-RNA干擾序列如下：siMoesin-1：5′-GGAUCUUGGCCUUGUGCA UTT-3′, siMoesin-2： 5′-GGGCUGAUGCUAUGGCCAATT-3′。

二、方法

1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在添加10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)和L-谷氨酰胺的RPMI-1640中，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下(5%CO2/37℃)培養(yǎng)。

2 RNA干擾 在500 μL空白培養(yǎng)基中分別加入5 μL干擾序列及轉(zhuǎn)染試劑lip2000，震蕩離心后混勻，靜置10 min。感染細(xì)胞后48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的濃度在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞。用CCK-8試劑盒在24、48和72 h后分別用酶標(biāo)儀檢測450nm和630nm的光密度值(OD值)。根據(jù)檢測結(jié)果繪制生長曲線。

4 Transwell 在細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)中，分別接種3-6×104細(xì)胞于含有200 μL 1%培養(yǎng)基Transwell小室中，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件(5%CO2/37℃)下培養(yǎng)24 h后用甲醇固定30 min，1 mL結(jié)晶紫過夜染色，后用PBS清洗1～2遍。用顯微鏡拍照計(jì)數(shù)，放大倍數(shù)為200X。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、STARBASE、OSluca 數(shù)據(jù)庫分析非小細(xì)胞肺癌患者中，Moesin高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)(見圖1)。

圖1 Moesin高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后相關(guān)

二、Moesin在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

用Western blot檢測正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B以及8個(gè)肺癌細(xì)胞系中的moesin蛋白的表達(dá)(圖2)。與正常細(xì)胞相比，moesin在肺癌細(xì)胞株中表達(dá)顯著上調(diào)。選取表達(dá)量中等的A549進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 Moesin在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

三、干擾Moesin可以抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移

在A549細(xì)胞株中，通過Tranwell法檢測顯示，敲弱組的遷移以及侵襲能力明顯降低，計(jì)數(shù)顯示差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)。通過Western blot法檢測干擾moesin后，EMT(上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)情況?？梢钥吹?，與對照組相比，干擾組Vimentin, N-cadherin表達(dá)均下調(diào)，E-cadherin,表達(dá)上調(diào)(圖3B、C)。

圖3 干擾Moesin對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的影響

四、干擾moesin可以抑制細(xì)胞增殖

在A549細(xì)胞株中，通過CCK-8法檢測顯示，敲弱組的增殖能力明顯降低，計(jì)數(shù)顯示差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。通過Western blot法檢測干擾moesin后，與增殖相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的表達(dá)情況。已有文獻(xiàn)報(bào)道，AKT,ERK信號通路可以調(diào)劑腫瘤細(xì)胞增殖[10]。可以看到，與對照組相比，p-AKT, p-ERK表達(dá)均下調(diào)，而總蛋白并無明顯變化(圖4B、C)。

圖4 干擾Moesin對A549細(xì)胞增殖及增殖標(biāo)志物的影響

討 論

本研究表明，Moesin在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)。

在非小細(xì)胞肺癌中，其高表達(dá)與肺癌患者分期及不良預(yù)后相關(guān)。并且，Moesin可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。并且揭示其通過下游AKT, ERK, EMT信號通路從而影響細(xì)胞表型。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，在HCC827細(xì)胞株中，Moesin可以介導(dǎo)Snail誘導(dǎo)的EMT相關(guān)的P-糖蛋白活性的增加，從而增加對紫杉醇的耐藥性。本研究已證實(shí)Moesin可通過EMT通路影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移。EMT是細(xì)胞從極化上皮表型向間充質(zhì)成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)變的生物學(xué)過程[11]，它可以下調(diào)E-cadherin等上皮蛋白的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin，Vinmentin等間充質(zhì)蛋白的表達(dá)[12]。同時(shí)，EMT也是EGFR-TKI耐藥機(jī)制之一[13-14]。這揭示Moesin蛋白在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。

在乳腺癌中，磷酸化Moesin與E3泛素連接酶SPOP競爭性結(jié)合PD-L1，從而穩(wěn)定PD-L1蛋白[15]。近十年來，檢查點(diǎn)阻斷免疫治療的發(fā)展取得了顯著進(jìn)展，特別是針對非小細(xì)胞肺癌PD-1和PD-L1的藥物[16]。這給我們在非小細(xì)胞肺癌中，Moesin具體作用機(jī)制提供了研究的新思路。

Moesin的作用提示其可能與相關(guān)基因的靶向治療存在潛在聯(lián)系，其機(jī)制還需要我們進(jìn)一步探索，助于我們找到癌癥靶向治療新的生物標(biāo)志物。