免疫檢查點抑制劑聯合放化療治療非小細胞肺癌的療效預測標志物研究進展

陳鴻志 周永慧 李燕 苗立云

肺癌已成為我國死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌占肺癌的85%～90%，且發病率呈逐年增高趨勢[1]。大多數非小細胞肺癌診斷時已出現遠處轉移，無法手術治療。放療、化療、靶向治療和抗血管生成治療是晚期非小細胞肺癌患者的主要治療方法。而腫瘤免疫治療在肺癌中的應用既往一直未有突破性的進展，其治療策略主要集中于直接提高抗腫瘤主動免疫(如過繼性細胞免疫治療)[2]。隨著對腫瘤免疫微環境研究的深入，免疫檢查點(immune checkpoint)在腫瘤免疫逃逸中的作用逐漸被重視，而針對免疫檢查點的抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)開始進入臨床應用，并顯示出一定的治療效果。其中，程序性死亡受體-1/配體-L1(programmed cell death 1，PD-1/Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)抑制劑已經獲批應用于晚期非小細胞肺癌的治療。

然而，免疫檢查點抑制劑(ICIs)單藥治療雖然有緩解期長等一些優點，但總體客觀有效率仍偏低。一些生物標志物的檢測可以預測免疫檢查點抑制劑的療效，目前推薦ICIs使用前，需明確免疫檢查點相關分子(如PD-L1)的表達水平，以提前發現目標獲益人群。這在一定程度上解決了ICIs盲目應用的問題，但單藥應用獲益人群比例不高。近年來，多項臨床研究表明ICIs聯合常規放、化療能夠顯著改善晚期非小細胞肺癌患者的預后，這為ICIs的臨床應用擴大了適應證，但預測ICIs單藥治療療效的生物標志物是否可用來指導其聯合常規放、化療尚不明確，如何篩選獲益較大的人群是目前臨床面臨的主要問題。本文就PD-1/PD-L1抑制劑及其與放、化療聯合應用的療效預測標志物進行綜述。

PD-1/PD-L1抑制劑的作用機制

免疫逃逸是惡性腫瘤的十大特征之一，導致腫瘤免疫逃逸的原因是腫瘤微環境中存在多種免疫抑制因素，其中包括免疫檢查點(immune checkpoint)的配體與受體結合、抑制細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化。免疫檢查點是一大類表達于免疫細胞、抗原遞呈細胞、腫瘤細胞等并發揮抑制或激活獲得性免疫系統的分子，包括CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG3、B7-H3、TIM3等[3]。

PD-1屬于CD28免疫球蛋白超家族的共抑制分子，其編碼基因PDCD1位于2號染色體,主要表達在激活的T細胞、B細胞表面和自然殺傷細胞表面，與程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)或程序性死亡蛋白配體-2(PD-L2)結合，抑制T細胞的抗腫瘤活性，所以PD-1/PD-L1信號通路成為抗腫瘤治療的重要靶點[4]。PD-L1在腫瘤細胞、免疫細胞、上皮細胞和內皮細胞都有表達，而PD-L2主要在激活的巨噬細胞和樹突狀細胞上表達。表達于腫瘤細胞或其他腫瘤間質細胞表面的PD-L1可以作用于CTL細胞表面受體PD-1，通過抑制PI3K/Akt和Ras-MEK-ERK信號通路抑制T淋巴細胞增殖、促進T淋巴細胞凋亡[5]。PD-1/PD-L1單抗通過阻斷PD-1和PD-L1的結合，解除CTL細胞的免疫抑制，恢復CTL細胞的抗腫瘤免疫功能。

目前國內外針對PD-1/PD-L1的抑制劑已有數種，主要包括PD-1單抗國外的Pembrolizumab(帕博利珠單抗)、Nivolumab(納武利尤單抗)、國內的Cemiplimab(西米普利單抗)、Tislelizumab(替雷利珠單抗)、Toripalimab(特瑞普利單抗)、Sintilimab(信迪利單抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠單抗)和PD-L1單抗國外的Durvalumab(度伐利尤單抗)、Atezolizumab(阿替利珠單抗)、Avelumab(阿維魯單抗)等。其中，Pembrolizumab、Nivolumab、Durvalumab和Atezolizumab單藥治療已被美國食品藥品監督管理局(FDA)批用于晚期非小細胞肺癌的二線治療,同時，Pembrolizumab被批準用于PD-L1高表達(腫瘤比例評分(TPS)≥50%)且無表皮生長因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因突變的晚期非小細胞肺癌患者的一線單藥治療[6]。

PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療的療效預測標志物

PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療總體客觀緩解率較低。CheckMate-063[7]、CheckMate-017[8]和CheckMate-057試驗[9]表明單用Nivolumab雖然與化療相比能夠提高晚期非小細胞肺癌治療的客觀緩解率，但均未超過20%。而Keynote-001試驗[10]表明，單用Pembrolizumab總體客觀緩解率也僅為27%。所以，如何提高ICIs治療靶標人群的客觀有效率是近年來研究熱點。一些可以預測ICIs治療療效的標志物被陸續報道，如腫瘤PD-L1表達、循環腫瘤細胞及其細胞PD-L1的表達、腫瘤浸潤性淋巴細胞、腫瘤突變負荷、微衛星不穩定性或腸道微生物群等，最新研究也發現IL-35和POLE基因在腫瘤免疫治療療效預測方面有著一定的作用。

一、腫瘤PD-L1表達

2015年FDA批準Pembrolizumab用于PD-L1表達≥50%的晚期非小細胞肺癌的一線治療，但應用Nivolumab或Atezolizumab的療效與PD-L1表達之間的關系還沒有完全得到證實。 Patel等[11]總結發現PD-L1表達陽性的非小細胞肺癌患者接受免疫治療有效率超過60%，而PD-L1表達陰性的患者治療客觀有效率很低。Keynote-001[10]、Keynote-010[12]和Impower-131[13]研究發現免疫治療在PD-L1陽性表達的患者中顯著獲益。而CheckMate-026研究[14]發現Nivolumab并沒有延長PD-L1表達≥50%的晚期非小細胞肺癌患者的總生存期和無進展生存期。以上不同研究結果導致PD-L1作為免疫治療的療效預測指標仍存在較大爭議，其中的原因可能有[11]：(1)各臨床研究關于PD-L1陽性表達的評判標準不同：在Keynote臨床試驗中，PD-L1表達≥50%為陽性表達，而在CheckMate-063和CheckMate-026試驗中，PD-L1表達≥5%即為陽性表達；(2)檢測腫瘤PD-L1表達的抗體和免疫組化方法均不同，因此得出的結論亦會有所差別；(3)腫瘤的異質性：由于PD-L1在腫瘤中的表達存在異質性，包括時間異質性及空間異質性，所以僅靠檢測局部PD-L1的表達并不能準確評價腫瘤免疫微環境；(4)PD-L1的表達亦與EGFR和KRAS基因突變有關,并且化療會影響PD-L1表達；(5)有研究表明，少部分PD-L1表達陰性的晚期非小細胞肺癌患者仍能從中獲益，因此對于PD-L1表達是否和免疫治療療效一定呈正相關，存在爭議[15]。因此，單獨憑借PD-L1表達水平并不能較全面的預測免疫治療預后。不過通過對PD-L1表達評估的標準化可能會進一步提高PD-L1的預測價值，目前常用的標準化指標有腫瘤比例評分(TPS，tumor proportion score)和聯合陽性評分(CPS，combined positivity score)[16]。

二、循環腫瘤細胞及循環腫瘤細胞上PD-L1的表達(CTC及CTC-PD-L1)

近年來，循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell，CTC)及其細胞PD-L1的表達(CTC-PD-L1)可作為新的非侵入性的預測晚期非小細胞免疫治療的長期動態監測標志物。CTC即為自發或因診療操作脫離原發灶或者轉移灶進入外周血液循環的腫瘤細胞。在Frick等[17]人的研究中發現，CTC可以用來預測早期非小細胞肺癌患者接受立體定向放療后的療效，更高的基線CTC會增加腫瘤復發的風險。Castello等[18]人亦發現CTC是非小細胞肺癌患者免疫治療無進展生存期及總生存期的獨立預測指標，那么是否有可能將CTC作為放療聯合免疫治療的預測標志物，這需要進一步的研究。Wang等[19]發現CTC-PD-L1表達陽性，是化療預后不佳的獨立預測因子，而化療可以誘導CTC-PD-L1表達的上調，化療聯合免疫治療可以增加抗腫瘤療效，從而使更多的患者獲益。但是，CTC及CTC-PD-L1是否可以準確預測免疫治療聯合放化療的療效，仍面臨著極大的考驗，這主要是有以下幾點原因：(1)檢出率低，不同檢測試劑盒、檢測數據庫之間有顯著差異；(2)CTC-PD-L1的檢測，需充分考慮在接受免疫治療前既往放化療、靶向治療等治療史的影響；(3)檢測成本高，耗費時間長。因此，雖然CTC及CTC-PD-L1相較腫瘤組織中PD-L1的表達檢測更加安全并且可以動態觀察，但是目前并不能取代其地位。

三、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)

腫瘤浸潤的淋巴細胞(Tumor Infiltrates Lymphocytes，TIL)是一群異質性很強的細胞，其中一部分是抗腫瘤效應細胞，在非小細胞肺癌中，TIL數量與患者的預后直接相關[20]。TIL通過細胞毒作用和介導免疫反應，導致腫瘤細胞的凋亡。TIL引起腫瘤細胞凋亡的分子機制包括：(1)TIL激活后，其分泌的IFN-γ等細胞因子增多，可以誘導非特異性免疫反應；(2)TIL通過穿孔素和顆粒酶等直接靶向腫瘤細胞，促進靶細胞凋亡。有研究顯示TIL數量可作為晚期非小細胞肺癌患者免疫治療療效的預測指標[19]，但在臨床試驗中尚未得到進一步證實。

四、腫瘤突變負荷(TMB)

腫瘤突變負荷(Tumor Mutational Burden，TMB)是指腫瘤細胞編碼基因突變的總和，包括堿基替換、基因插入、缺失錯誤等的總數[21]。腫瘤細胞編碼基因的突變預示著腫瘤相關特異性抗原的產生，所以理論上突變越多，腫瘤新抗原(Neoantigen)產生越多，免疫治療療效越好。CheckMate-227等研究均證實高腫瘤突變負荷的患者從免疫治療獲益更多[22]。但是，腫瘤突變負荷作為免疫治療生物標志物仍面臨著極大的挑戰，主要有以下幾種原因：(1)腫瘤突變負荷因不同計算方法或檢測基因的數量多少會導致不同的結果，目前主要用來檢測腫瘤突變負荷的方法主要有FoundationOne CDx和MSK-IMPACT[23]；(2)腫瘤突變負荷閾值的判定在各研究中差別大。如CheckMate-026[14]研究中直接定義為突變數量(低突變負荷，<100 mutations；中等突變負荷100 to 242 mutations；高突變負荷>243 mutations)，而CheckMate-227[22]將腫瘤高突變負荷定義為腫瘤突變負荷≥10 mutations/Mb；(3)基因突變可能會干擾免疫治療的效果；(4)重復腫瘤組織活檢的局限性及危險性。近年來，關于測量血漿中的腫瘤突變負荷(bTMB)的phase Ⅱ POPLAR和phase Ⅲ OAK研究，顯示基于血液的TMB檢測可以預測Atezolizumab治療非小細胞肺癌的無進展生存期[24],但是目前這一技術尚不成熟。最近，趙呈龍等[25]發現PD-L1≥50%且高腫瘤突變負荷組患者免疫治療療效最佳，雖然研究例數較少，不足以代表大數據，不過這可以提出是否將二者聯合作為預測標志物的可能，更準確的篩選出獲益人群。非小細胞肺癌特別是肺腺癌存在多種驅動基因的突變，而針對這類驅動基因突變的靶向治療有明確療效，目前的免疫治療尚不能證明優于這類靶向治療，因此是否可以將腫瘤突變負荷表達高低作為免疫治療療效預測標志物，仍需更多大樣本研究。

五、微衛星不穩定性(MSI)

微衛星不穩定性(Microsatellite Instability，MSI)是基因組不穩定中的一種，主要特點是短的重復的DNA序列發生缺失或擴增等改變，常常導致基因發生移碼突變。Hause等[26]發現多種腫瘤中存在微衛星高度不穩定性，且與患者預后相關。CheckMate 142[27]研究發現微衛星高度不穩定性結腸癌患者對PD-L1抑制劑具有較好的療效。最近的分析發現多種腫瘤都可表現為微衛星不穩定，這提示是否可以將為衛星不穩定認為是廣泛的腫瘤表型。不過也有研究表明微衛星高度不穩定在結直腸癌及胃腺癌中占比較高，而在肺癌中發生率較低[26]。此外，與其他免疫治療生物標志物存在相同的問題，包括微衛星不穩定性的檢測方法、劃分閾值以及伴有其他基因突變是否會影響免疫治療療效，均存在爭議。因此是否可將微衛星不穩定性作為晚期非小細胞肺癌患者免疫治療療效的預測標志物仍有待研究。

六、腸道微生物群

腸道微生物在腫瘤發生及治療中的作用近年來逐漸被認識。Obata等[28]發現腸道微生物可以通過調節T細胞分化成熟來影響腸道黏膜的免疫系統從而保持腸道免疫耐受。腸道微生物可以通過影響腸黏膜免疫進而調節人體免疫系統。而Routy等[29]發現將對免疫治療反應率高的腸道微生物移植到無菌或經抗生素治療后的小鼠體內能夠改善其療效，而臨床數據提示接受抗生素治療的患者無進展生存期及總生存率均較低，這可能是因為抗生素的使用擾亂了腸道菌群、抑制了晚期非小細胞肺癌患者的免疫檢查點治療，其中具體機制目前尚不明確。國內一項小樣本研究[30]分析了37例患者腸道微生物的多樣性，發現微生物多樣性與PD-1單抗的療效相關。但目前仍缺乏大樣本、前瞻性研究證實這一結論。

七、其他

還有研究探索了其它一些與免疫治療療效相關的分子標記物，如體重指數(Body mass index，BMI)、中性粒細胞與淋巴細胞比值、基因表達標簽(Gene expression profiles，GEPs)、POLE基因突變等，而EGFR等驅動基因突變陽性晚期非小細胞肺癌患者接受ICIs治療療效偏低[31]。但這些指標尚未得到大樣本臨床試驗驗證。

PD-1/PD-L1抑制劑聯合放化療療效預測標志物

上述各個指標基本來自于ICIs單藥治療的臨床數據，但目前更為急迫的是尋找能夠指導PD-1/PD-L1抑制劑聯合放化療合理應用的標志物。

放化療對腫瘤微環境具有調節作用。一方面，放療可以通過直接或間接破壞腫瘤細胞DNA誘導腫瘤細胞發生免疫原性死亡，同時放療可以上調腫瘤細胞表面的PD-L1表達水平并上調抗原遞呈細胞MHC-I類分子和CD86的表達,同時小劑量的射線可以清除抑制性T淋巴細胞[32]。 另一方面，化療對非小細胞肺癌細胞具有免疫調變作用并改善腫瘤微環境。化療藥物可誘導腫瘤細胞免疫原性的凋亡，通過“損傷相關分子模式”(damage-associated molecular patterns，DAMPs)啟動免疫應答[33],同時化療預處理可以清除免疫抑制性細胞并下調免疫抑制性細胞因子的表達形成促進免疫效應的微環境[34]。因此，盡管尚無直接的研究探索PD-1/PD-L1抑制劑聯合放化療的療效預測標志物，我們認為可以動態監測腫瘤免疫微環境的指標，如監測腫瘤PD-L1表達、腫瘤浸潤性淋巴細胞、腫瘤突變負荷等指標的動態變化,用以指導PD-1/PD-L1抑制劑和放化療的聯合應用。但動態監測腫瘤免疫微環境，需要對腫瘤進行再次活檢，可喜的是，有臨床研究報道這種再活檢是相對安全的[35]。

結 論

ICIs已成為晚期非小細胞肺癌治療的重要方法之一，但在臨床應用中仍受到一定限制，療效預測標志物的研發可以避免盲目的應用并提高治療療效。目前ICIs與常規放、化療的聯合應用顯示出更廣泛的應用前景，但目前尚缺乏深層次的理論基礎來指導這種聯合治療模式的合理應用。本文初步總結了免疫檢查點抑制劑聯合常規放、化療療效可能的預測指標，以期為進一步的研究提供方向。