手術(shù)切除肺腺癌患者免疫細(xì)胞浸潤分析及預(yù)后關(guān)系

孫如坤 劉巖 潘春香 胡祥坤 鹿敏

我國肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)在惡性腫瘤中居首位[1]。早期非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后5年生存率約70%，約30%的手術(shù)患者會復(fù)發(fā)，且兩年生存率僅為17%[2]。肺癌組織除腫瘤細(xì)胞外，還存在多種基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，共同組成免疫抑制微環(huán)境[3]。腫瘤免疫細(xì)胞主要為：腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，髓樣抑制細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[4]。不同免疫細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演不同作用[5-6]。不同腫瘤免疫微環(huán)境直接影響預(yù)后，通過分析免疫細(xì)胞浸潤模式，可以建立準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測模型[7]。目前免疫細(xì)胞分析主要集中在晚期患者，早期手術(shù)患者免疫細(xì)胞浸潤與預(yù)后關(guān)系研究鮮有報(bào)道，本研究基于GEO數(shù)據(jù)集分析手術(shù)切除肺腺癌免疫浸免疫浸潤特征及其與預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)下載與處理

利用R軟件(V 4.0.2)從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE68465數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集基于GPL96芯片平臺，共462個(gè)樣本，其中肺腺癌樣本442例，和20例正常組織樣本，利用R包將探針名轉(zhuǎn)換為基因名，得到12402個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

二、免疫細(xì)胞浸潤分析

免疫細(xì)胞浸潤分析采用CIBERSORT算法[8]，利用R軟件加載CIBERSORT分析包、LM22參考基因集和未標(biāo)準(zhǔn)化的GSE68465芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對樣本中22種免疫細(xì)胞進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣本的22種細(xì)胞比例之和為1，各細(xì)胞占的百分比代表該類型免疫細(xì)胞在樣本中的浸潤水平，根據(jù)P值小于0.05選擇結(jié)果可信的樣本，用于后續(xù)可視化和預(yù)后分析。

三、生存分析

在R軟件中，利用Survival包，對22種免疫細(xì)胞依次進(jìn)行生存分析，以CIBERSORT計(jì)算的細(xì)胞比例中位數(shù)將患者分為高浸潤組和低浸潤組，以總生存率(OS)為生存指標(biāo)，繪制Kaplan-Meier(KM)曲線，Log Rank檢驗(yàn)兩組間生存曲線差異，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

四、基于免疫細(xì)胞浸潤構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型

在R軟件中，利用Survival包，對22種免疫細(xì)胞依次單變量Cox回歸分析，選擇P值小于0.05的免疫細(xì)胞進(jìn)行Cox 多變量回歸分析，構(gòu)建肺腺癌手術(shù)患者免疫細(xì)胞預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分(Risk score)中位數(shù)將分為高風(fēng)險(xiǎn)組(High risk)和低風(fēng)險(xiǎn)組(Low risk)，并繪制Kaplan-Meier生存曲線和受試者工作特征(ROC)曲線，評估免疫細(xì)胞預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測效果。

結(jié) 果

一、肺癌組織免疫細(xì)胞浸潤分析

GSE68465數(shù)據(jù)集共包含462個(gè)樣本，其中肺腺癌樣本442例，和20例正常組織樣本，用CIBERSORT算法，篩選出具有CIBERSORT輸出P值小于0.05的樣本進(jìn)行研究，本研究中所有樣本P值均小于0.05。(圖1)為所有樣本中22種免疫細(xì)胞比例。其中比例最高的三種免疫細(xì)胞是漿細(xì)胞(Plasma cells)、M2巨噬細(xì)胞(Macrophages M2)和M0巨噬細(xì)胞(Macrophages M0)。

圖1 肺腺癌組織免疫細(xì)胞浸潤情況

二、肺癌組織與正常肺組織免疫細(xì)胞浸潤差異比較

進(jìn)一步比較肺腺癌組織與正常肺組織的22種免疫浸潤細(xì)胞差異(圖2)，結(jié)果顯示18種免疫細(xì)胞浸潤比例均與正常肺組織有顯著差異(P<0.0001)，其中肺癌組織中比例顯著升高的有初始B細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化CD4+記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，比例顯著下降的細(xì)胞有初始CD4+T細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。進(jìn)一步通過主成分分析(PCA)，結(jié)果顯示(圖3)，肺腺癌樣本與正常肺組織樣本分布明顯不同。以上結(jié)果提示肺腺癌組織與正常組織免疫浸潤模式顯著不同。

圖2 肺腺癌組織與正常組織免疫細(xì)胞浸潤比較。LUAD：肺腺癌組織；Normal：正常肺組織；****表示P<0.0001

圖3 基于免疫浸潤細(xì)胞PCA圖

三、肺腺癌組織免疫細(xì)胞浸潤的預(yù)后價(jià)值

選擇434例有預(yù)后數(shù)據(jù)的肺腺癌樣本，包括273例Ⅰ期患者(64.4%)，94例Ⅱ期患者(22.2%)和67例Ⅲ期患者(14.8%)，利用Kaplan-Meier分析評估22種免疫細(xì)胞在肺腺癌手術(shù)患者中的預(yù)后價(jià)值，如圖4所示，僅靜息NK細(xì)胞與預(yù)后關(guān)系顯著(P<0.05)，靜息NK細(xì)胞升高提示術(shù)后總生存期低，是獨(dú)立的預(yù)后因子，其他類型免疫細(xì)胞對預(yù)后的影響均不顯著(P>0.05)。

圖4 免疫細(xì)胞浸潤與肺腺癌手術(shù)患者預(yù)后關(guān)系

四、基于免疫細(xì)胞浸潤構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

對22種免疫浸潤細(xì)胞，進(jìn)行單變量Cox回歸分析，其中靜息NK細(xì)胞(NK cells resting)、活化CD4+記憶T細(xì)胞(T cells CD4 memory activated)、活化肥大細(xì)胞(Mast cells activated)、M0巨噬細(xì)胞(Macrophages M0)、活化樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells activated)和漿細(xì)胞(Plasma cells)等6種類型免疫細(xì)胞與預(yù)后關(guān)系顯著(P<0.05)。基于這6種免疫細(xì)胞進(jìn)行逐步回歸分析，建立最優(yōu)預(yù)后評分模型，Cox回歸結(jié)果(見表1)。最終得到5種免疫細(xì)胞的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，公式為Risk Score=8.156×(靜息NK細(xì)胞)+9.059×(活化CD4+記憶T細(xì)胞 )+ 3.899×(靜息肥大細(xì)胞 )+ 2.452× (M0巨噬細(xì)胞)+5.575×(活化樹突狀細(xì)胞)，5種免疫細(xì)胞均為β>0且HR>1，表明均為預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分模型，計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)得分分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，利用Kaplan-Meier分析兩組患者總生存期差異，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后與低風(fēng)險(xiǎn)組相比顯著較差(圖5，P<0.0001)，繪制ROC曲線評估風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測能力，結(jié)果顯示1年、3年和5年生存的AUC面積為分別0.905、0.698和0.761，提示該風(fēng)險(xiǎn)評分模型可以可靠地預(yù)測患者預(yù)后(見圖6)。

表1 多變量Cox回歸

圖5 高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組總生存期Kaplan-Meier曲線

圖6 免疫風(fēng)險(xiǎn)評分模型的ROC曲線

討 論

對于早期肺腺癌患者，手術(shù)治療是患者最佳的治療選擇，基于美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)的TNM分期系統(tǒng)與術(shù)后生存顯著相關(guān)，目前臨床根據(jù)TNM分期對早期肺腺癌進(jìn)行分層治療，但TNM分期越高，預(yù)后越差，5年生存率顯著降低，以鉑類為主的輔助化療對Ⅱ期和ⅢA期患者的5年生存期有顯著改善[9-10]，對ⅢA期患者，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新輔助療法對已經(jīng)有相關(guān)的臨床試驗(yàn)在開展中，但目前為止尚未得到有效的數(shù)據(jù)。因此，開發(fā)新的肺癌術(shù)后預(yù)測分子標(biāo)志物具有重要意義，有助于對早期肺腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，篩選預(yù)后差和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的人群，輔助化療或新的免疫輔助療法有可能改善這類人群的預(yù)后。

近年來，越來越多的研究表明，免疫微環(huán)境在肺癌的發(fā)展和惡化中扮演著重要角色。本研究中，我們利用生物信息學(xué)手段，評估了早期肺腺癌患者的免疫細(xì)胞浸潤情況，PCA分析結(jié)果表明肺癌組織與正常肺組織的免疫細(xì)胞情況有明顯差異，揭示肺腺癌組織在早期就形成了特定的免疫微環(huán)境[11]，早期肺癌組織中，比例最高的3種免疫細(xì)胞是漿細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞作為腫瘤組織中主要的免疫浸潤細(xì)胞，是調(diào)控腫瘤和炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞類型[12]。巨噬細(xì)胞的主要狀態(tài)是經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)和替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2)，巨噬細(xì)胞具有抑制或促進(jìn)腫瘤的兩極分化表現(xiàn)，M1巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)生細(xì)胞因子，募集T細(xì)胞，最終吞噬腫瘤細(xì)胞；而M2巨噬細(xì)胞具有相反的作用，促進(jìn)腫瘤免疫抑制[13]。進(jìn)一步分析22種免疫細(xì)胞與患者總生存期的關(guān)系，僅發(fā)現(xiàn)靜息NK細(xì)胞對預(yù)后影響顯著，靜息NK細(xì)胞含量高提示預(yù)后差，且CIBERSORT分析得出肺癌組織靜息NK細(xì)胞比例顯著低于正常組織。一項(xiàng)針對肺癌組織的單細(xì)胞測序研究提示，靜息NK在肺癌組織中的比例顯著低于正常組織[14]，此外，Li 等利用Cox回歸建立的肺癌10基因預(yù)后模型中，低風(fēng)險(xiǎn)組靜息NK細(xì)胞比例顯著低于高風(fēng)險(xiǎn)組[15]，目前，NK細(xì)胞與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚未完全闡明，研究顯示暴露于癌細(xì)胞中的NK細(xì)胞會表現(xiàn)為未活化狀態(tài)并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]，因此未活化的NK細(xì)胞可能是肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素和潛在免疫治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步，我們通過單變量和多變量Cox回歸，建立了基于5種免疫細(xì)胞的肺腺癌手術(shù)患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型，基于該模型得到的低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后顯著好于高風(fēng)險(xiǎn)組，ROC曲線結(jié)果也證明該模型可以有效地預(yù)測患者預(yù)后。近年來，大量研究報(bào)道了基于免疫細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)評分模型是一種有效的預(yù)后預(yù)測工具，并在多種癌癥中得到證明，但其在臨床實(shí)踐中應(yīng)用的可行性還需大量的驗(yàn)證工作[17]。

總之，本研究利用生物信息學(xué)手段，分析了肺腺癌組織中免疫細(xì)胞浸潤情況及與術(shù)后生存的關(guān)系，利用單變量和多變量Cox回歸分析篩選預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞類型并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型，表明免疫浸潤模型是一種有效的肺腺癌手術(shù)患者預(yù)后預(yù)測手段。