非小細(xì)胞肺癌中IGF1、IGFBP2表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析

閆明 程紀(jì)偉 孫海波 鄭燕 邢文群

肺癌是一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，80%左右的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌，其早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已為晚期[1-2]。盡管目前肺癌治療方法不斷進(jìn)步，更加個體化和多樣化，但其療效和預(yù)后仍不理想，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[3]。尋找與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物，可能對預(yù)后改善有重要意義。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)可通過與其受體特異性結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞分化[4]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGF binding protein 2，IGFBP2)是一種潛在的腫瘤相關(guān)抗原，在多種人類惡性腫瘤患者中均存在表達(dá)異常[5-6]。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測非小細(xì)胞肺癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)，探討二者與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為非小細(xì)胞肺癌治療提供新靶點。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年2月～2016年2月于本院就診且經(jīng)胸部影像學(xué)及組織病理學(xué)等確診的226例非小細(xì)胞肺癌患者癌組織為非小細(xì)胞肺癌組，患者年齡49～76歲，平均年齡(60.48±9.26)歲，男136例(60.18%)，女90例(39.82%)；選取其癌旁正常組織為癌旁對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①非小細(xì)胞肺癌患者符合診療規(guī)范[7]；②術(shù)前未接受過放療、化療等輔助治療；③病歷資料齊全；④患者年齡>18歲，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，且所有受試者均自愿參加，同時簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重肝功能異常、其他感染性疾病或腎功能異常者；②有精神障礙或認(rèn)知功能障礙者；③伴有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；④孕婦或哺乳期婦女。

二、主要試劑與儀器

IGFBP2抗體(貨號：bs-1108R)購自上海科敏生物科技有限公司；IGF1抗體(貨號：SPC-699D)購自加拿大StressMarq公司；通用型免疫組化試劑盒(貨號：ZK-SP10449)購自深圳子科生物科技有限公司。

三、研究方法

1 一般資料收集 收集整理非小細(xì)胞肺癌患者一般資料，主要包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期。

2 治療方案 所有患者術(shù)后1周內(nèi)接受化療，21 d為一個周期，共4個周期。化療方案分別為：吉西他濱+奈達(dá)鉑、吉西他濱+奧沙利鉑、培美曲塞+奈達(dá)鉑、多西他賽+奈達(dá)鉑、多西他賽+順鉑。患者均未接受抗血管生成、放療及靶向藥物治療。

3 IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)檢測 采集非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)中癌組織及癌旁正常組織，10%甲醛固定標(biāo)本后，進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。用免疫組織化學(xué)法檢測癌組織及癌旁正常組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)水平。按照通用型免疫組化試劑盒說明書中操作步驟進(jìn)行操作，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性的肺組織切片作陽性對照。隨機(jī)選10個視野于200倍鏡下進(jìn)行觀察，計數(shù)100個細(xì)胞，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色定義為陽性細(xì)胞，采用半定量法進(jìn)行評分。按染色強度計分：棕褐色、棕黃色、淺黃色、無色分別為3分、2分、1分、0分；按陽性細(xì)胞比例計分：陽性細(xì)胞比例1/3以下、1/3～2/3、2/3以上分別為1分、2分、3分。根據(jù)二者計分乘積為最終得分進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：≤2分為低表達(dá)，>2分為高表達(dá)。

4 隨訪 采用電話、門診或入戶方式隨訪5年，平均術(shù)后第1年每月1次，術(shù)后第2年每3個月1次，2年后每半年1次。其生存期從手術(shù)之日起計算，隨訪時間截至2021年2月。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例數(shù)(n)或百分率(%)表示，組間比較行Pearson卡方檢驗；采用Spearman法分析非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達(dá)的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法分析非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，用Log-rank進(jìn)行生存曲線顯著性檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05；采用多因素COX回歸分析影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的因素。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、非小細(xì)胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)水平比較

非小細(xì)胞肺癌組IGF1、IGFBP2蛋白高表達(dá)率高于癌旁對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1、圖1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)水平比較[n(%)]

圖1 非小細(xì)胞肺癌組和癌旁對照組IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×200)(A：癌旁對照組IGF1蛋白低表達(dá)；B：非小細(xì)胞肺癌組IGF1蛋白高表達(dá)；C：癌旁對照組IGFBP2蛋白低表達(dá)；D：非小細(xì)胞肺癌組IGFBP2蛋白高表達(dá))

二、非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中IGF1、IGFBP2蛋白是否高表達(dá)，將患者分為IGF1低表達(dá)組60例、IGF1高表達(dá)組166例；IGFBP2低表達(dá)組69例、IGFBP2高表達(dá)組157例。結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)(見表2)。

表2 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

三、非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman分析結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.472，P<0.05)(見表3)。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1與IGFBP2蛋白表達(dá)的相關(guān)性(n)

四、非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier法分析非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)與患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示IGF1高表達(dá)患者五年生存率(33.33%)低于IGF1低表達(dá)患者五年生存率(69.23%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，χ2=10.051)；IGFBP2高表達(dá)患者五年生存率(29.41%)低于IGFBP2低表達(dá)患者五年生存率(73.33%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，χ2=16.397)(見圖2、圖3)。

圖2 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

圖3 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGFBP2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

五、影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

以非小細(xì)胞肺癌患者是否發(fā)生死亡(是=1，否=0)為因變量，以IGF1(高表達(dá)=1，低表達(dá)=0)、IGFBP2(高表達(dá)=1，低表達(dá)=0)、腫瘤大小(≥3.0 cm=1，<3.0 cm=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、組織分化程度(低分化=1，中/高分化=0)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，I～Ⅱ期=0)為自變量進(jìn)行多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示，IGF1高表達(dá)、IGFBP2高表達(dá)、TNM Ⅲ～Ⅳ期是影響非小細(xì)胞肺癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)(見表4)。

表4 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

討 論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌中常見的組織類型，其具體的分子機(jī)制尚未完全闡明，是由多基因參與的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞周期紊亂是引發(fā)非小細(xì)胞肺癌的重要因素[8]。正常細(xì)胞周期受內(nèi)外信號的調(diào)控，以維持其正常的細(xì)胞增殖、凋亡，然而癌細(xì)胞為非正常凋亡機(jī)制，可避免程序性死亡[9]。IGF作為調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的重要因子，在細(xì)胞增殖、凋亡及分化中起重要作用，其功能障礙或失調(diào)會對機(jī)體生長發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，均可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。

IGF1是IGF家族的一員，主要作為一種生長激素在幾乎所有細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可通過調(diào)控癌細(xì)胞對內(nèi)皮的粘附性以及血管生成，影響腫瘤侵襲能力[12]。此外IGF1也可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)癌基因的表達(dá)，啟動細(xì)胞增殖分裂、抑制細(xì)胞凋亡[13]。IGFBP2可通過調(diào)節(jié)IGF的量，來影響IGF系統(tǒng)，增強IGF參與代謝及有絲分裂等方面的作用，進(jìn)而影響腫瘤生長[14]。IGFBP2也可不經(jīng)過IGF系統(tǒng)影響腫瘤細(xì)胞，其主要通過促進(jìn)或抑制某些腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)水平，影響腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織IGF1、IGFBP2蛋白高表達(dá)率高于癌旁正常組織，且非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中二者表達(dá)呈正相關(guān)。孫宇等[16]研究結(jié)果中，IGF1在肺鱗癌患者癌組織中呈高表達(dá)，Wang等[17]研究結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中IGFBP2表達(dá)上調(diào)，與本研究IGF1、IGFBP2表達(dá)趨勢一致。提示IGF1、IGFBP2可能通過高表達(dá)，影響非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析癌組織IGF1、IGFBP2表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，IGF1、IGFBP2與非小細(xì)胞肺癌患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置無關(guān)，而與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期有關(guān)，且IGF1、IGFBP2高表達(dá)患者5年生存率較低。提示IGF1、IGFBP2可能與非小細(xì)胞肺癌的遷移、侵襲等行為密切相關(guān)，高水平的IGF1、IGFBP2可能會增加細(xì)胞內(nèi)有絲分裂信號傳導(dǎo)、增加細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，從而增加惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，加速患者病情發(fā)展，不利于患者預(yù)后。然而陶紹能等[18]研究中IGF1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)，造成此結(jié)果的差異可能與選取樣本量有關(guān)，仍需進(jìn)一步驗證。此外，本研究采用多因素COX回歸分析影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示，IGF1、IGFBP2均是影響患者死亡的獨立危險因素。提示臨床工作中可對IGF1、IGFBP2表達(dá)水平給予密切關(guān)注，以便及時調(diào)整患者治療方案，改善不良預(yù)后。

綜上所述，IGF1、IGFBP2高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可為化療方案的確定、提高患者診療效果提供新思路，同時對IGF的研究可能為今后尋找新的腫瘤標(biāo)記物和治療靶點起到積極的推動作用。然而本研究同時存在一定的不足之處，IGF1、IGFBP2蛋白表達(dá)可能與腫瘤類型、患者機(jī)體狀態(tài)等多方面因素有關(guān)，有待今后納入更多樣本，進(jìn)行多層次、多中心的研究來進(jìn)一步證實。