miR?744?5p和miR?543在HIV相關神經認知障礙患者外周血單個核細胞中的表達及臨床意義

桂林 何文林 黃遠帥 田剛

西南醫科大學附屬醫院1輸血科，3檢驗科（四川瀘州646000）；2瀘州市疾病預防控制中心（四川瀘州646699）

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）不僅破壞機體免疫系統，還可穿透血腦屏障入侵大腦，具有噬神經性，導致原發性中樞神經系統損傷，即HIV 相關的神經認知障礙（HIV?as?sociated neurocognitive disorders，HAND）［1］。雖 然聯合抗反轉錄病毒治療能顯著延長HIV 感染者生存期，且減少HAND 終末期患者數量，但仍有40%左右的HIV 患者出現輕型HAND，且是HIV 患者出現癡呆的主要原因［2］。HAND的致病機制由多途徑、多機制共同參與，現今為止還未有報道準確提出HIV 導致神經退行性病變的病理機制。MicroRNAs（miRNAs）在大腦中大量表達，可調節突觸可塑性和大腦發育，因此miRNAs 異常失調可能導致神經認知功能障礙［3］。相關研究發現，miRNA?1?3p、miRNA?21?5p 是術后早期認知功能障礙的重要預測因子［4］。因此，探索更多靈敏且有效的生物標志物對預測和輔助診斷HAND 具有重要臨床意義。本研究旨在分析HIV 感染患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）中miR?744?5p 和miR?543 的表達水平，并探索其差異表達對HAND 的臨床診斷價值，以期為臨床有效預防、診療HAND 提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年7月至2019年9月在我院收治的HIV?1 感染者76 例，其中男49 例，女27例，年齡24～56歲，平均（39.85±9.02）歲。采用神經心理測驗（neuropsychological，NP）對所有患者進行神經認知功能評估［5］，最終確定HAND 患者45例（HAND組），非HAND患者31例（對照組）。兩組患者性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：（1）所有患者均經ELISA 檢測初篩為HIV?1 抗體陽性，且經Western blot 法證實；（2）符合艾滋病診療診斷第3 版（2015 版）。排除標準：（1）進行過聯合抗逆轉錄病毒療法的患者；（2）患中樞神經系統腫瘤的患者；（3）具有嚴重的頭部損傷史的患者；（4）多發性硬化癥和其他癡呆癥的患者；（5）患心腦血管疾病的患者；（6）成癮性藥物濫用史的患者。本研究通過科研倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品公司）；COBAS AmpliPrep 試劑盒（瑞士羅氏公司）；RNA 分離試劑盒（美國Ther?mo Fisher 公司）；Realtime PCR 熒光定量試劑盒（Taqman）（北京索萊寶科技有限公司）；BD Si?multest TM CD3/CD4 抗體（美國BD 公司）；低溫高速離心機ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；COBAS AmpliPrep?COBAS TaqMan 病毒定量檢測儀（瑞士Roche 公司）；美國BD 公司的FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；AU5800 全自動生化分析儀（美國BECKMAN 公司）；酶標儀（美國BioRad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT?PCR法檢測患者PBMCs中miR?744?5p和miR?543 表達水平抽取5 mL 靜脈血于EDTA抗凝管中，加入等量D?Hanks 液混勻。將混勻的抗凝血沿管壁加入淋巴細胞分離液，2 000 r/min 離心20 min。利用吸管小心吸取中間乳白色層細胞置1.5 mL EP 管，采用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMCs，得到PBMCs。使用RNA 分離試劑盒提取總RNA，使用SuperScriptTMVILOTMcDNA 合成試劑盒對總RNA 進行逆轉錄，然后使用Realtime PCR熒光定量試劑盒（Taqman）行RT?qPCR。引物信息：miR?744?5p 上游引物5′?AAGGTGCGGGGC?TAGGGCTAA?3′，下游引物5′?AGTAAGGTTGAG?GTTA?3′；miR?543 上游引物5′?GGACACAATGC?CACCTGTG?3′，下游引物5′?GGGAAGACGGGA?GCTTTCAT?3′；U6 上游引物5′?CT?CGCTTCGGC?AGCACA?3′，下游引物5′?AACGCTTC ACGAATTT?GCGT?3′。程序如下：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40 個循環。以U6 為內參，采用2?△△Ct法計算miR?744?5p 和miR?543 相對表達量。

1.3.2 HIV?1 病毒載量和CD4+T 淋巴細胞計數檢測采用EDTA 抗凝真空采血管，采集5 mL 全血，室溫1 500 r/min 離心10 min，吸出血漿，分裝至凍存管。采用超敏感法制備RNA，即高速離心濃縮血漿中HIV?1 病毒顆粒后，通過裂解液分離血漿中的病毒顆粒，再利用乙醇沉淀RNA。采用瑞士Roche 公司的COBAS AmpliPrep?COBAS TaqMan 病毒定量檢測儀和人類免疫缺陷病毒（Ⅰ型）核酸檢測試劑盒（PCR?熒光法），嚴格按照儀器和試劑盒操作說明書進行檢測。病毒載量檢測范圍為20 ～1×107copies/mL，檢測靈敏度為≤20 copies/mL，重復性CV 值≤0.3 log。取50 μL 全血，加入20 μL CD3/CD4 抗體勻混，避光靜置15 min，加入450 μL溶血液混勻，避光靜置15 min 后，采用FACS Cali?bur 流式細胞儀進行檢測，利用MultiSET 軟件進行計數分析。

1.3.3 炎癥指標IL?6、IL?10、IL?16、IL?18和TNF?α檢測取患者靜脈血4 mL，2 500 r/min 離心10 min取血清，采用ELISA 法檢測白細胞介素6（interleu?kin?6，IL?6）、白細胞介素10（interleukin?10，IL?10）、白細胞介素16（interleukin?16，IL?16）、白細胞介素18（interleukin?18，IL?18）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）水平等血清炎癥指標。

1.3.4 脂代謝指標HDL、TG、LDL 和TC 檢測取患者靜脈血4 mL，2 500 r/min 離心10 min 取血清，采用全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白（high?density lipoprotein，HDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low?density lipoprotein，LDL）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平等血清脂代謝指標。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0 統計軟件分析數據。計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗。采用Pearson 相關性分析法分析miR?744?5p 和miR?543 與慢性炎癥指標、脂代謝指標的相關性。多因素logistic 風險回歸分析HIV?1 感染患者發生HAND事件的獨立危險因素。受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）評估miR?744?5p和miR?543對HAND的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者CD4+T 淋巴細胞計數以及病毒載量比較HAND 組患者平均CD4+T 淋巴細胞計數為（265 ± 96）個/μL，HIV?1 病毒載量為（3.51 ± 1.09）lg copies/mL。對照組患者平均CD4+T 淋巴細胞計數為（242 ± 83）個/μL，HIV?1 病毒載量為（3.36 ±1.22）lg copies/mL。兩組CD4+T 淋巴細胞計數和VL比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者CD4+T 淋巴細胞計數以及病毒載量比較Tab.1 Comparison of CD4+T lymphocyte count and viral load between the two groups ±s

表1 兩組患者CD4+T 淋巴細胞計數以及病毒載量比較Tab.1 Comparison of CD4+T lymphocyte count and viral load between the two groups ±s

組別對照組HAND組t值P值例數31 45 CD4+T淋巴細胞計數（個/μL）242.00±83.00 265.00±96.00 0.875 0.382病毒載量（lg copies/mL）3.36±1.22 3.51±1.09 0.699 0.487

2.2 兩組患者PBMCs 中miR?744?5p 和miR?543表達水平比較與對照組比較，HAND 組miR?744?5p 表達量顯著升高（P＜0.001），而miR?543 表達量顯著降低（P＜0.001）。見表2。

表2 兩組患者PBMCs 中miR?744?5p 和miR?543 表達量比較Tab.2 Comparison of expression of miR?744?5p and miR?543 in PBMCs of patients between the two groups ±s

表2 兩組患者PBMCs 中miR?744?5p 和miR?543 表達量比較Tab.2 Comparison of expression of miR?744?5p and miR?543 in PBMCs of patients between the two groups ±s

組別對照組HAND 組t 值P 值例數31 45 miR?744?5p 1.62±0.67 5.89±1.61 15.898＜0.001 miR?543 4.39±1.64 1.59±0.53 9.140＜0.001

2.3 兩組患者炎癥及脂代謝指標比較與對照組比較，HAND 組炎癥指標IL?10 和IL?16 表達水平明顯升高（P＜0.05），其他指標差異無統計學意義（P＞0.05）；脂代謝指標HDL 含量明顯降低（P＜0.05），其他指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組患者炎癥及脂代謝指標比較Tab.3 Comparison of inflammation and lipid metabolism between the two groups ±s

表3 兩組患者炎癥及脂代謝指標比較Tab.3 Comparison of inflammation and lipid metabolism between the two groups ±s

組別IL?6（pg/mL）IL?10（pg/mL）IL?16（pg/mL）IL?18（pg/mL）TNF?α（pg/mL）HDL（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）TC（mmol/L）對照組（n=31）82.68±2.38 14.04±2.96 10.81±2.76 19.35±4.54 48.65±4.53 0.90±0.08 1.52±0.16 2.15±0.63 3.95±0.84 HAND 組（n=45）81.84±4.25 18.78±2.28 12.92±1.75 21.06±5.42 46.88±6.28 0.80±0.08 1.49±0.32 2.43±0.88 3.74±0.53 t 值0.997 7.866 3.770 1.442 1.345 5.205 0.481 1.522 1.337 P 值0.322＜0.001 0.001 0.154 0.183＜0.001 0.632 0.132 0.185

2.4 HIV?1 感染者發生HAND 的危險因素以HIV?1 感染患者是否發生HAND（是=1，否=0）為因變量，以miR?744?5p、miR?543、IL?10、IL?16 和HDL為自變量，進行多因素logistic 風險回歸分析，結果表明，PBMCs 中miR?744?5p 高表達和miR?543 低表達均為HAND 的獨立危險因素。見表4。

表4 多因素logistic 風險回歸分析HIV?1 感染者發生HAND 的危險因素Tab.4 Multivariate logistic regression analysis of risk factors for HAND in HIV?1 infected patients

2.5 miR?744?5p 和miR?543 與炎癥及脂代謝指標的Pearson相關性分析HAND患者PBMCs中miR?744?5p 表達水平與HDL 水平呈負相關（r=-0.695，P＜0.001），與IL?10 和IL?16 水平呈正相關（r=0.843、0.596，P＜0.001）；而miR?543 表達水平與HDL 水平呈正相關（r= 0.660，P＜0.001），與IL?10和IL?16 水平呈負相關（r=-0.874、-0.676，P＜0.001）。

2.6 PBMCs中miR?744?5p和miR?543表達水平預測HIV感染患者HAND發生事件的診斷價值ROC曲線結果顯示，miR?744?5p 預測HIV?感染患者HAND 發生的ROC 曲線下面積為0.975（95%CI：0.941 ～ 1.000，P＜0.001），臨界值為2.425，敏感度為95.6%，特異度為93.5%，約登指數為0.891。miR?543 預測HAND 發生的ROC 曲線下面積為0.954（95%CI：0.903 ～ 1.000，P＜0.001），臨界值為2.210，敏感度為90.3%，特異度為91.1%，約登指數為0.814。miR?744?5p 和miR?543 聯合預測HAND發生的ROC曲線下總面積為0.983（95%CI：0.960～1.000，P＜0.001）。見圖1。

圖1 miR?744?5P、miR?543 及聯合對HIV?1 感染者發生HAND 事件的ROC 曲線評估Fig.1 ROC curve evaluation of miR?744?5p，miR543 and combination on HAND event in HIV?1 infected patients

3 討論

神經認知能力下降嚴重影響HIV?1 患者的日常生活。因此，識別具有發生神經認知障礙風險的HIV?1 感染患者將有助于HAND 早期診斷和干預［6］。然而，迄今為止，臨床還未發現針對HAND的可靠有效的生物學標志物。雖然聯合抗逆轉錄病毒療法大大提高了HIV?1 患者的預期壽命，降低了嚴重癡呆癥的發病率，但并沒有改善HAND 發病率［7］。HIV?1 患者常患多種合并癥，包括丙型肝炎病毒合并感染、代謝疾病、抑郁癥和阿爾茨海默病［8-9］。自殺意念在HIV 患者中相對普遍，與多種因素有關，包括重度抑郁癥和藥物濫用。這種自殺行為和非法物質的使用以及社會經濟因素的存在對識別該患者群體中神經認知衰退的生物標志物提出了挑戰。

miRNA 在體液中的高度穩定性使其被認為是多種病理的潛在生物標志物，包括神經退行性疾病和精神疾病［10-11］。研究發現，hsa?miR?30b?5p 在多種類型的神經退行性疾病中具有重要功能，其通過脂肪酸合成和代謝以及神經元分化和存活影響神經退行性疾病的發展［12］。miR?196a 通過調控Tat 蛋白作用神經元功能障礙，影響HAND 的發展［13］。國外臨床研究發現并驗證，在參加HIV 抗逆轉錄病毒治療的血漿樣本中，存在9 個miRNA可有效區分是否患認知障礙的患者。另外，該研究還發現15 對miRNA 區分HAND，其中包括miR?744?5p 和miR?543［14］。本研究通過比較HAND 患者和對照組患者外周血PBMCs 中miR?744?5p 和miR?543 的表達水平，結果發現與對照組比較，HAND 患者外周血PBMCs 中miR?744?5p 表達水平升高，而miR?543 表達水平降低，且miR?744?5p 和miR?543 均為HIV?1 感染者發生HAND 的獨立危險因素，對HIV?1 感染者發生HAND 具有良好的臨床診斷價值。HIV?1 感染的一個臨床標志是出現慢性炎癥，全身炎癥反應在慢性HIV 感染過程中持續存在，對疾病的發展有重要作用。研究發現，血漿生物標志物IL?10、IL?23 以及24 h 外周血PBMCs上清液生物標志物IL?17 能影響HIV?1 陽性患者發生神經退行性病變［15］。本研究發現，HAND 患者的血清慢性炎癥指標IL?10 和IL?16 表達水平較對照組升高。miR?744?5p 與IL?10 和IL?16 指標呈正相關，而miR?543 與IL?10 和IL?16 呈負相關。這與之前的研究提出的，抑制miR?744 表達能有效緩解眼部炎癥［16］，人工注射miR?543?5p 后炎癥介質下調［17］的結論類似。研究發現，HDL 和TG 通過影響胰島素敏感性導致接受抗逆轉錄病毒治療的HIV感染患者的認知能力下降［18］。本研究發現，HAND患者的脂代謝指標HDL 表達水平較對照組降低，且miR?744?5p 表達水平與其呈負相關，miR?543 表達水平與其呈正相關。另外，本研究還發現miR?744?5p 高表達和miR?543 低表達均對HIV?感染患者發生HAND 有良好的臨床診斷價值，且聯合診斷效果更佳。

綜上所述，本研究通過鑒定出HIV?1 患者認知能力下降的miRNA 生物標志物，為開發用于監測HIV?1 患者認知缺陷和藥物使用模式的非侵入性和新型診斷工具奠定了基礎。成功將敏感和特異的神經生物標志物在臨床上進行應用，以減少神經功能衰退和藥物使用的進展，最終將有助于提高聯合抗逆轉錄病毒治療的依從性和患者生活質量。