玻璃化冷凍和程序化冷凍人卵巢組織的效果

劉艷麗 申峻涵 杜姍姍 劉景 申春艷 肖小帥 管一春

鄭州大學第三附屬醫院生殖中心（鄭州450000）

近年來，惡性腫瘤的發病率逐年增高且呈年輕化，其中70%腫瘤患者有生育需求［1］。醫療技術的進步和治療方案的改進使腫瘤患者生存率得到明顯提高，但腫瘤的化、放療及手術治療對患者的生育力帶來不可逆轉的損傷，造成女性卵巢早衰、閉經甚至生育力喪失，嚴重影響其生殖功能和生存質量［2］。因此，生育力保存成為亟待解決的熱點問題。

女性生育力保存方法包括卵子冷凍、胚胎冷凍和卵巢組織冷凍［3］。卵子/胚胎冷凍保存技術是一項非常成熟的技術，但需控制促排卵過程，可能會延遲疾病的治療，對青春期前女性、兒童和激素依賴性腫瘤患者進行超促排卵亦為禁忌。卵巢組織冷凍技術可一次性將數百甚至上千個竇前卵泡保存起來，不僅保存了生育能力，還能恢復生殖內分泌功能。卵巢組織冷凍適合于青春期前HPO 軸未成熟、沒有足夠時間進行超促排卵和激素敏感性腫瘤患者［4］，成為保存女性生育力最具潛力的選擇。卵巢組織冷凍常用的方法有玻璃化冷凍法和程序化冷凍法，不同的學者對兩種方法效果孰優孰劣存在著爭議，尚未定論。因此，本文針對這一問題，從組織學、單個卵泡的分離計數和卵巢組織體外培養等方面對不同卵巢組織冷凍方案冷凍效果進行評價，為臨床開展卵巢組織冷凍工作提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 卵巢組織來源收集2020年1-12月在鄭州大學第三附屬醫院12 例因卵巢疾病患者需手術切除的卵巢組織標本?；颊吣挲g28 ～ 37 歲，其中卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤2 例，宮頸癌行附件切除術3 例，畸胎瘤2 例，卵巢巧克力囊腫5 例。患者近6 個月無服用激素藥物史，術前3 個月未進行放化療。本研究經鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 卵巢皮質的制備將手術切除的卵巢組織用生理鹽水沖洗干凈，去除血跡。在超凈工作站內處理卵巢組織。若卵巢組織表面有肉眼可見的卵泡，用注射器抽取卵泡液，用眼科剪小心去除卵巢髓質，將卵巢皮質處理至1 mm 厚度。用手術刀將處理好的卵巢皮質剪成10 mm×10 mm×1 mm 的組織塊，并隨機分為新鮮對照組、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組，每組6 塊進行后續的實驗，其中新鮮對照組未經過冷凍處理。

1.3 卵巢組織的玻璃化冷凍及復蘇采用商品化的試劑盒（KITAZATO VT301S/VT302S）。在室溫條件下，將卵巢皮質片放入冷凍液1（cryo1）和冷凍液2（cryo2）中各5 min，然后在玻璃化液3（cryo3）中15 min 進行組織的透化脫水，最后放在冷凍載桿上，投入液氮中冷凍保存。復蘇時取出待解凍的卵巢組織片，迅速投入37 ℃的解凍液1 中，1 min后于室溫下依次放在解凍液2 中3 min 和解凍液3中5 min。

1.4 卵巢組織的程序化冷凍及復蘇冷凍液是含有10%白蛋白的PBS 基礎液，將處理好卵巢皮質塊切片放置預先加入0.8 mL 冷凍保護液（1.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L 蔗糖）的冷凍管中，4 ℃平衡25 min后放入可編程冷凍儀中，按以下程序進行冷凍：從20 ℃開始以2 ℃/min 降至-8 ℃，植冰，保持10 min，再以0.3 ℃/min 降至-30 ℃，以30 ℃/min 降至-197 ℃，直接投至液氮中冷凍保存。復蘇時從液氮罐中取出冷凍管，室溫2 min，37 ℃水浴箱中水浴2 min，肉眼可見冰晶完全溶解后，取出卵巢組織置于培養液中。

1.5 卵巢組織的形態學分析將新鮮組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織各兩片置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，以4 μm 厚度連續切片，蘇木精和伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）進行染色。所有組織均進行連續切片，在高倍顯微鏡下隨機選擇含有卵泡的10 個視野進行形態學分析。根據國際認可的Gougeon 標準進行卵泡分級，完整的卵泡形態有完好的細胞核，核內核仁清晰，卵泡基底膜完整，卵泡周圍的顆粒細胞分布均勻。若出現卵母細胞皺縮或核固縮、顆粒細胞排列紊亂、顆粒細胞與卵母細胞分離或與卵泡周圍的基膜分離及基底膜不完整中任一項，視為異常卵泡。卵泡的完整率=計數的完整卵泡數/計數的所有卵泡數。另根據組織學分析結果篩選出8 例患者卵巢組織中富含各級卵泡，用于后續的卵泡計數和卵巢皮質培養。

1.6 卵巢組織中卵泡的計數將新鮮對照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織塊，采用機械法和酶法進行消化，將卵巢組織放入1.5 mL的EP 管中，用眼科剪將卵巢組織剪碎，加入1 mL Liberase DH 酶于37 ℃恒溫水浴箱消化，消化完全后加入終止液，離心后留取0.5 mL 混懸液倒入培養皿中，在體視顯微鏡下用170 μm 的剝卵針挑取各級竇前卵泡并分類計數，卵泡分級標準參照Gougeon 分級標準。

1.7 卵巢皮質的體外培養E2水平可以反映卵巢組織的內分泌功能和卵泡的活性的主要指標。分別取新鮮對照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組的卵巢組織塊放在四孔培養皿中，每孔加入0.6 mL 培養液中進行培養，每48 小時進行半量換液，收集體外培養卵巢組織的培養液，采用電化學光法檢測培養液中E2水平（儀器和試劑均為羅氏），判斷不同冷凍方法對卵巢組織中卵泡內分泌功能的影響。

1.8 統計學方法采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用率（%）表示；根據分組方法，計量資料采用隨機區組設計方差分析；分類變量采用Cochran′s 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢組織形態學改變與新鮮卵巢組織相比，玻璃化冷凍組始基卵泡和竇前卵泡形態學上無明顯差異，結構完整，顆粒細胞分布均勻，基質緊密，僅少數次級卵泡出現僅卵母細胞形態不規則，細胞質內出現空泡，核濃縮；程序化冷凍組卵巢組織次級卵泡皺縮現象明顯增多，顆粒細胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現，間質疏松；程序化冷凍組次級卵泡形態學上損傷高于玻璃化冷凍組，見圖1。

圖1 各組卵巢組織中的卵泡形態（HE×400）Fig.1 Follicular morphology in ovarian tissues of each group（HE×400）

計數新鮮對照組、玻璃化冷凍組和程序化冷凍組卵巢組織各級卵泡，玻璃化冷凍組和程序化冷凍組始基卵泡的完整率均明顯低于新鮮對照組（P＜0.001）；程序化冷凍組的次級卵泡完整率明顯低于新鮮對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同冷凍方案各級卵泡的完整率Tab.1 The follicle integrity rate in all levels with different freezing methods 例（%）

2.2 卵巢組織混懸液中不同級別卵泡的計數程序化冷凍組卵巢組織混懸液始基卵泡、初級卵泡和次級卵泡的密度均明顯低于新鮮對照組（P＜0.05）；玻璃化冷凍組卵巢組織混懸液中初級卵泡和次級卵泡密度和新鮮對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。卵巢組織混懸液中各級卵泡的形態見圖2。

圖2 卵巢組織混懸液中分離出的各級卵泡（×400）Fig.2 All levels of Follicles isolated from ovarian tissue suspension（×400）

表2 不同冷凍方案卵巢組織混懸液中各級卵泡的計數Tab.2 The number of follicles in ovarian tissue suspension with different Freezing methods±s，個/100 μL 混懸液

表2 不同冷凍方案卵巢組織混懸液中各級卵泡的計數Tab.2 The number of follicles in ovarian tissue suspension with different Freezing methods±s，個/100 μL 混懸液

注：與新鮮對照組相比，*P＜0.05

分組玻璃化冷凍組程序化冷凍組新鮮對照組F值P值始基卵泡76.50±8.91*79.67±10.40*91.50±8.70 9.214 0.001初級卵泡24.72±3.70 22.83±3.74*27.33±3.02 5.028 0.016次級卵泡10.33±3.05 9.50±3.46*12.55±3.25 3.872 0.037

2.3 卵巢組織體外培養上清液中E2 水平卵巢皮質體外培養初期階段（D2?D6），玻璃化冷凍組和程序化冷凍組卵巢皮質體外培養的雌二醇水平均低于新鮮卵巢組，差異有統計學意義（P＜0.05）；當培養至D8，程序化冷凍組E2水平明顯低于新鮮對照組，D10?D14，兩冷凍組E2水平與新鮮對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 體外培養各組卵巢皮質中E2濃度Fig.3 The concentration of E2 in the ovarian cortex of each group cultured in vitro

3 討論

2004年，DONNEZ 等［5］首次報道人類卵巢組織凍融和移植取得成功；2014年，MACKLON 等［6］報道了患者進行凍融卵巢組織移植5年后獲得了活產嬰兒，為凍融卵巢組織移植術后的長期時效增加了證據支持。卵巢組織冷凍不僅保存了一定數量的卵泡，還可恢復女性的生殖內分泌功能，是激素敏感型腫瘤的最佳生育力保存方法。人卵巢組織冷凍和自體移植后活產率為25.4% ～ 30.6%，已被證實為生育力保存的有效方法［7］。美國生殖醫學會指出對于希望保留生育能力的年輕癌癥患者，卵巢組織冷凍和移植不再是試驗性的方法［8］。

程序化冷凍和玻璃化冷凍均為保存卵巢組織常用的方法。程序化冷凍采用低濃度的冷凍保護劑，對細胞毒性小，是目前公認的是卵巢組織冷凍的標準方法，但需昂貴的程序化冷凍儀，步驟繁瑣，耗時較長，易產生細胞內冰晶致細胞損傷。玻璃化冷凍無需任何設備，簡便易行，使細胞內外的液體物質迅速通過冷凍敏感區，最大限度避免細胞內冰晶形成和降低細胞的損傷，亦被認為是保存卵巢組織有效的方法［9-10］，但采用濃度相對較高的冷凍保護劑對卵巢組織的毒性尚不明確。LEE 等［11-12］認為程序化冷凍能更好地保存人卵巢組織中卵泡活性和細胞增殖能力，玻璃化冷凍技術對始基卵泡的形態上造成較嚴重的損傷；SILBER 等［13-14］認為相對于程序化冷凍而言，玻璃化冷凍技術可能更適合冷凍卵巢組織，尤其是卵巢基質細胞。TERRACIANO 等［15］等認為玻璃化方案可以更好地保存卵巢干細胞，實現卵泡的自我更新和再生，適用于卵巢早衰導致的不孕。SUGISHITA等［16］發現玻璃化冷凍和程序化冷凍法復蘇的卵巢組織卵泡分布的密度、形態學差異及DNA 碎片率無顯著差異；盡管卵巢組織冷凍已進行了大量的研究，但關于兩種冷凍方法的優劣尚未定論。

本文從卵巢組織冷凍前后卵泡形態學改變、卵巢組織混懸液中卵泡密度和卵巢組織體外培養液中的E2變化方面進行研究，分析玻璃化冷凍法和程序化冷凍法的冷凍效果。本實驗的結果顯示兩種方法凍存卵巢組織中始基卵泡的效果相似，始基卵泡的完整率差異無統計學意義；兩冷凍組始基卵泡的完整率均明顯低于新鮮對照組，說明冷凍過程對卵泡有一定的損傷；程序化冷凍組卵巢組織次級卵泡完整率與新鮮對照組相比有明顯差異，且低于玻璃化冷凍組，說明程序化冷凍對次級卵泡的保存效果較差。KLOCKE 等［17-18］認為兩種方法在保存卵泡活性上相當，但玻璃化冷凍對于卵巢基質保存效果更好；LABRUNE 等［19］認為玻璃化冷凍保存卵泡形態優于程序化冷凍組，這均與本文的結果一致。DALMAN 等［14］認為程序化冷凍比玻璃化冷凍對次級卵泡保存效果好，可能是因為程序化降溫速度和玻璃化冷凍方案存在差異。

卵泡是女性最基本的生殖單位，卵巢組織冷凍過程中卵泡的完好是冷凍成功的關鍵。本實驗中竇狀卵泡數量太少，因此未進行統計。本研究兩冷凍組卵巢組織混懸液的始基卵泡密度均明顯低于新鮮對照組（P= 0.001），說明冷凍保存過程中卵泡有損傷；程序化冷凍組卵巢組織混懸液中初級和次級卵泡密度均明顯低于新鮮對照組，玻璃化冷凍組和新鮮對照組相比無明顯差異，說明玻璃化冷凍法對初級和次級卵泡的保存效果優于程序化冷凍法。DESAI 等［20］認為玻璃化冷凍組單個卵泡的損傷較??；SANFILIPPO 等［21］認為玻璃化冷凍組卵巢皮質中卵泡的密度0.6 個/mm2高于程序化冷凍組0.5 個/mm2；HERRAIZ 等［22］認為玻璃化冷凍后卵巢組織始基卵泡密度大于程序化冷凍組；雖然后兩者分析卵巢組織切片中卵泡的密度，但對于單個卵泡的保存效果有一定的提示作用。

卵巢組織體外培養無需分離單個卵泡，卵泡的活性不會因酶解或機械分離而受損。另外，卵巢組織體外培養保持了卵母細胞及其與周邊支持細胞間的結構［18］。卵巢皮質體外培養一方面反映出解凍后卵泡的生長能力，另一方面也反映出冷凍過程對各級卵泡的損傷程度。本研究通過測定卵巢組織體外培養的卵泡液E2的折線圖看出，在體外培養過程中，卵巢組織能夠繼續生長，并具有一定的內分泌功能。培養的初始階段（D2?D6），兩冷凍組卵巢組織分泌的E2水平較低，相對于新鮮卵巢組織差異均有統計學意義，可能原因：其一，冷凍的卵巢皮質復蘇后可能存在一個適應階段，逐漸恢復其活性；其二，E2主要靠初級或次級卵泡分泌，在冷凍過程中，因初級卵泡和次級卵泡體積增大、卵泡液增多，冷凍損傷相對較大。隨著培養時間的延長（D8?D14），始基卵泡或初級卵泡發育并逐漸成熟，兩冷凍組卵巢皮質培養液中E2與新鮮培養組接近，差異無統計學意義（P＞0.05），這說明玻璃化冷凍和程序化冷凍可較好的保存卵巢組織中卵泡的活性，特別是始基卵泡和初級卵泡；LOCATELLI 等［23］報道的體外培養的羊卵巢組織E2的分泌遵循相同的趨勢，兩種冷凍法卵巢組織的E2在培養的第6 天后顯著增加，在培養的D9 與新鮮組織E2分泌量相近；OKTEM 等［24］研究結果顯示，人新鮮卵巢組織、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組卵巢組培養至D3，新鮮卵巢組織的E2水平明顯高于兩冷凍組。與本研究的結果相似。

此外，從經濟效益學分析，程序化冷凍法需要昂貴的程序化冷凍儀和消耗大量的液氮，操作步驟繁瑣，用時較長，消耗大量的人力和物力；玻璃化冷凍法無需大型冷凍設備，簡便易行，冷凍過程相對較短（＜30 min），其發展方向有可能像胚胎的玻璃化一樣普遍。

由于標本收集的特殊性，本研究納入的標本量相對較小，存在一定的局限性，結果可能不完全具有代表性，應擴大樣本量進一步驗證。且本文主要針對不同冷凍方法對卵泡活性的研究，對移植后卵巢皮質的基因表達和激素水平尚需在后續的研究中進一步評估。

綜上所述，無論采取何種冷凍方案，卵巢組織均能很好的耐受冷凍損傷，保存大部分卵泡活性。相對于程序化冷凍，玻璃化冷凍卵巢組織起步相對較晚，但操作簡便、高效，且對次級卵泡的保存效果較好，其臨床應用將如同胚胎和卵子玻璃化冷凍一樣普遍。另外，冷凍過程應考慮卵巢皮質的制備、冷凍保護劑的高滲透率和低毒性、操作人員的專業技能等因素，才能達到最佳的冷凍保存效果。人凍融卵巢組織的發育潛能尚需大量的異種移植實驗進一步驗證。