慢性乙型肝炎病毒感染者不同疾病時期及Peg?干擾素抗病毒治療前后T細胞及其亞群CD107a的變化

顧琳 黃澤旋 李靜 黃月華， 顧玉榮

中山大學附屬第三醫院1廣東省肝臟病研究重點實驗室，2感染性疾病科（廣州510630）

長期、慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是發生肝功能衰竭、肝硬化等嚴重肝病的重要危險因素之一［1］。HBV 感染所引起的肝損傷主要由免疫反應所介導［2］，T 細胞免疫在HBV 感染時發揮重要作用［3］。CD107a 被稱為溶酶體相關膜蛋白?1（LAMP?1）［4］，是溶解顆粒中最豐富的蛋白之一，在活化的細胞毒性T 細胞（CTL 細胞）中表達［5-7］。CTL細胞殺傷靶細胞時，CD107a分子被轉運到細胞膜表面，引起顆粒內容物釋放，使靶細胞死亡［8］，因此，CD107a 分子被認為與T 細胞的細胞毒活性直接相關，可反映細胞殺傷水平［9］。但慢性HBV感染時高水平HBV 抑制患者適應性免疫反應，T細胞功能出現不同程度損傷［10］，是造成HBV 慢性感染最重要的原因［11-12］。目前關于HBV 感染患者不同疾病階段及干擾素抗病毒治療后T 細胞毒性分子CD107a 變化的研究較少［10］。本文對T 細胞CD107a 分泌在慢性HBV 感染不同階段的變化、與臨床病毒學指標間的關系及Peg?干擾素抗病毒治療對T 細胞CDl07a 分泌能力的影響進行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2016年8月1日至2018年4月1日于中山大學附屬第三醫院感染性疾病科門診就診的慢性HBV 感染患者，將患者分為未抗病毒治療組（n=300）和干擾素治療組（n=36，HBeAg陽性，ALT ＞2 ULN）。排除肝硬化、肝癌以及其他原因肝病、HIV 感染以及高血壓、糖尿病等其他慢性疾病。根據2018年美國肝病學會慢乙肝指南，將未抗病毒治療患者進一步分為免疫耐受期（IT）組（n= 29），免疫活動期（IA）組（n= 174），非活動期（IC）組（n= 44）和灰色區（GZ）組（n= 53）。同時納入17 例健康志愿者作為健康對照（HC）組。本研究獲醫院倫理委員會批準，并獲得入組患者書面知情同意。

1.2 主要試劑和儀器Roche COBAS 法檢測血清HBV?DNA，范圍為20～1.7×108IU/mL，電化學發光法檢測HBsAg 定量、HBeAg 和HBcAb（羅氏公司），AU640 全自動生化分析儀檢測肝功能（日本奧林巴斯）。采用FibroScan 進行肝臟硬度值（LSM）檢測（EchosensSA）。APR及FIB評分使用國際通用公式。

1.3 流式細胞儀檢測外周血單個核細胞（PBMC）（1）采集患者外周全血20 mL，采用密度梯度法分離獲取PBMC，加入淋巴細胞刺激劑（ebioscience）培養4 h。（2）洗滌離心，加入流式抗體ECD?CD3、V450?CD8（BD）及PE?CY7?CD4（Biolegend）孵育0.5 h 進行表面標記染色。（3）洗滌離心，加入破膜、固定劑（ebioscience）4 ℃孵育45 min。（4）使用perm buffer 洗滌離心，加入PE?CD107a（BD）抗體進行胞內染色。（5）洗滌重懸后，上機檢測（Gallios 流式細胞儀），并使用FlowJo 軟件進行數據分析。

1.4 統計學方法采用SPSS 23.0 進行數據處理。非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann?WhitneyU或Kruskal?Wallis檢驗，抗病毒治療前后比較采用配對符號秩和檢驗，分類資料比較使用χ2檢驗，相關性采用Spearman 相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較未抗病毒治療組和抗病毒治療組患者年齡和性別差異無統計學意義（P＞0.05），肝功能、肝硬度、HBV 抗原方面差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。未抗病毒治療組不同時期患者的年齡、肝功能、肝硬度及病毒學指標差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 未抗病毒治療組和干擾素治療組患者一般資料比較Tab.1 Comparison between Non?antiviral treatment group and Interferon treatment group M（P25，P75）

表2 未抗病毒治療組患者不同疾病時期一般資料比較Tab.2 Comparison of patients in different stages of Non?antiviral treatment group M（P25，P75）

2.2 不同疾病時期患者T細胞及其亞群中CD107a表達分布IA 期的慢性HBV 感染者T 細胞分泌CD107a 水平均顯著高于IT 及IC 期患者。IA 患者CD4 T 細胞CD107a 分泌水平也明顯高于健康對照組（HC），IT 期患者CD8 T 細胞CD107a 分泌水平明顯低于GZ 期。見圖1。

圖1 不同時期慢性HBV 感染者和健康對照組CD3、CD4、CD8 T 細胞CD107a 水平比較Fig.1 Comparison of CD107a among different stages and healthy controls

2.3 T 細胞及其亞群CD107a 分泌與肝臟炎癥、肝纖維化的相關性慢性HBV 感染者T 細胞CD107a分泌水平與ALT、AST、膽紅素及肝臟硬度值、APRI及FIB?4 評分均呈正相關（均P＜0.01），見表3。

表3 T 細胞CD107a 分泌與肝臟炎癥及纖維化的相關性Tab.3 The correlation among CD107a and hepatic inflammation and fibrosis

2.4 T 細胞及其亞群CD107a 分泌與HBV 復制相關性與HBeAg（-）患者相比，HBeAg（+）患者T 細胞CD107a分泌水平更高（均P＜0.05），且HBV DNA定量高的患者T 細胞CD107a 分泌水平也顯著高于HBV DNA定量低者（均P＜0.05）。HBsAg水平不同的患者，CD107a 分泌無差異，見表4。

表4 不同病毒學水平的患者T 細胞及其亞群CD107a 分泌比較Tab.4 The comparison of CD107a between patients with different virus statues M（P25，P75）

2.5 Peg?干擾素抗病毒治療前后T 細胞及其亞群CD107a 分泌能力比較在干擾素治療組，治療48 周后患者病毒指標及ALT 水平較基線明顯下降（P＜0.05），見圖2。不論患者是否發生HBeAg 血清學轉換以及HBV DNA 轉陰，其基線及48 周時的T 細胞CD107a 分泌均無差異（P＞0.05）。而干擾素治療48 周后，患者T 細胞及其亞群CD107a 分泌能力較治療前顯著提高（P＜0.001），見圖3。

圖2 Peg?干擾素治療48 周前后ALT、HBsAg、HBV DNA 變化Fig.2 ALT，HBsAg and HBV DNA levels before and after treatment with Peg?interferon

圖3 Peg?干擾素治療48 周前后T 細胞及其亞群CD107a 水平差異Fig.3 The level of CD107a before and after Peg?interferon treatment

3 討論

T 細胞與HBV 感染肝臟損傷及疾病狀態密切相關。急性HBV 感染時，T 細胞是清除HBV 的主要效應細胞［13-14］，但慢性HBV 感染時，T 細胞數量減少、清除病毒能力下降，致使HBV 持續感染，同時部分T 細胞（尤其是CTL）活化是引起肝組織慢性炎癥主要原因［15］。CTL 殺傷HBV 感染靶細胞主要有兩種方式：一是細胞裂解性殺傷，分泌穿孔素等介質損傷靶細胞膜，另一種是誘導細胞死亡，通過Fas 信號通路或釋放CD017a 誘導靶細胞死亡。

本研究發現慢性HBV 感染不同疾病階段，T細胞毒性能力不同，IA 期T 細胞CD107a 分泌的細胞毒作用均顯著高于IT 及IC 期患者，與肝臟炎癥、纖維化及HBV 復制水平均呈正相關。這些結果提示，IA 期患者T 細胞及其亞群CD107a 分泌的細胞毒作用最強，這可能是造成該時期患者肝臟損傷的重要原因之一。

HBV 感染時肝實質炎癥主要為抗原非特異性炎癥細胞所致，肝組織病理顯示凋亡的肝細胞和CTL 數量遠遠超過單核和多形核細胞，提示CTL 在HBV 感染肝損傷中發揮重要作用［16-17］。而CD107a 為T 細胞活化和脫顆粒的標志，抗原（包括細菌、病毒等）刺激后顯著升高，能夠可靠地評估T細胞的細胞毒活化情況［4］。本研究也顯示慢性HBV感染者T 細胞毒功能與肝臟的炎癥指標顯著相關，進一步支持T 細胞活化為HBV 肝損傷的重要機制。慢性肝臟炎癥可導致肝纖維化逐漸加重，炎癥程度越重，纖維化進展也越明顯［18］，正如本研究所發現的T 細胞CD107a 與肝臟纖維化指標具有明顯相關性。盡管肝硬度、APRI 評分等無創性檢查有助于臨床診斷肝纖維化和硬化，但仍無法取代肝穿刺活檢，由于肝穿刺活檢為有創傷性檢查，臨床應用受限，故本研究未能以肝臟病理活檢結果作為“金標準”來進行，這也是本研究的不足之處。

本研究發現T 細胞毒作用與病毒學具有顯著正相關性，提示HBV 可在不同程度上刺激機體免疫系統活化，引起T 細胞毒作用增強，發揮抗病毒效應以殺傷HBV 感染的肝細胞，進一步打破免疫耐受狀態，促使宿主進入IA 期，這也解釋了為何IA 期患者T 細胞毒作用高于IT 期。然而，T 細胞毒作用在抗病毒治療反而更高，可能與病毒下降緩解了病毒成份對機體的免疫抑制有關，也可能與干擾素可能通過提高T 細胞毒作用而發揮抗病毒效應有關，但其確切的原因尚需進一步深入研究。

HBV 感染時機體的免疫變化極其復雜，肝細胞損傷及HBV 清除與宿主、遺傳及病毒等多種因素有關。目前關于慢性HBV 感染不同疾病階段及長效干擾素抗病毒治療前后T 細胞及其亞群CDl07a 分泌細胞毒功能動態變化的研究較少，本研究補充了這方面的信息，揭示了自然疾病狀態下HBV 感染者T 細胞CD107a 分泌與肝臟炎癥纖維化、病毒復制相關，經長效干擾素治療后雖然肝臟炎癥減輕，但T 細胞CD107a 分泌反而進一步增強，可能與干擾素通過增強T 細胞這一細胞毒功能來發揮抗病毒作用有關。