二氫楊梅素通過ERK和p38途徑抑制人胃癌AGS細胞的增殖并誘導其凋亡

陸 崠， 王承黨

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國的發病人數約占全球的40%。近年來，胃癌的治療效果有所提高，但進展期患者的生存率仍不理想，多數患者就診時已是中晚期，導致干預滯后，預后不佳。因此，在胃癌發展前期，尋找有效的癌癥靶點和抗癌物質，對于降低胃癌的發病率至關重要。據報道，食源性植物類化合物可誘導細胞凋亡進而干擾癌細胞生長[1]。最新的流行病學研究表明，富含天然植物類化合物的飲食可誘導癌細胞的凋亡[2]，采用植物源天然產物作為抗腫瘤藥物可能是一種有效的抗癌療法。

多酚類物質是一類有效的抗癌化學物質[2-3]，其對胃癌的抑制作用已得到驗證，且未出現類似傳統癌癥治療中發生的相關副作用[4]。二氫楊梅素也稱蛇葡萄素，是從藤茶莖葉中提取出來的多酚類化合物的主要活性成分[5]，具有消炎、抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂和抗腫瘤等多種生理藥理功效[6]，在多種癌癥中可通過上調抗凋亡蛋白/凋亡前體蛋白(Bcl-2/Bax)的相對含量、激活胱天蛋白酶(caspase)和內質網應激途徑，從而誘導癌細胞凋亡[7]，且對正常細胞影響較小[8]。而二氫楊梅素誘導人胃癌AGS細胞發生凋亡是否也是由類似通路介導，目前尚不清楚。本研究擬通過利用胃癌AGS細胞株，探討二氫楊梅素對細胞活力的干預效果和作用機制，探究其對細胞凋亡的影響以及可能的相關信號轉導通路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 二氫楊梅素(純度95%，美國Sigma公司)；抗體Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、細胞外調節激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、p-ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2、p-JNK1/2、p38、p-p38和β-肌動蛋白(上海圣克魯斯生物技術公司)。干電印跡系統及Chemi Doc XRS成像系統(Bio-Rad，美國伯樂公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒及BD Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)。其他化學藥品均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 AGS細胞株來自中國醫學科學院北京協和醫學院細胞中心。采用含10%胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)及1%青霉素/鏈霉素的改良RPMI-1640培養基，于室溫37 ℃、體積分數為0.05的CO2中培養細胞。

1.2.2 細胞活力測定 采用MTT法，在96孔板中以每孔5×104個細胞的密度確定細胞活力。參照文獻[7]的方法，細胞經孵育過夜后，將培養基更換為含磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或不同濃度二氫楊梅素的新鮮培養基，孵育24 h后，每孔添加25 μL MTT溶液(5 mg/mL，pH值為7.4)，37 ℃下進一步孵育4 h。孵育結束后，吸出上清液，每孔再加入150 μL DMSO，置于回轉振蕩器上震蕩30 min，并用分光光度計測定570 nm波長處的光密度(optical density, OD)。

1.2.3 流式細胞術磷脂結合蛋白V/PI染色檢測各組細胞凋亡情況 采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測二氫楊梅素誘導的AGS細胞凋亡率。先將1×106mL-1的AGS細胞接種于含完全培養基的6孔板中，附著24 h。第2天，棄去培養基，加入含不同濃度(10～80 μmol/L)二氫楊梅素的新培養基，空白對照組僅添加0.1%的DMSO(0 μmol/L二氫楊梅素)。將細胞在37 ℃、體積分數為0.05的CO2中孵育72 h，用胰蛋白酶消化并以磷酸鹽緩沖液洗滌，按照試劑盒說明書進行染色。采用流式細胞儀分析染色的細胞，并以配套軟件處理數據。

1.2.4 蛋白質提取和蛋白質印跡分析 AGS細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，用含1%苯基甲基磺酰氟和20 mmol/L氟化鈉的緩沖液進行裂解。收集細胞裂解液，于4 ℃下15 000 r/min離心10 min。分離細胞質和線粒體，測定蛋白濃度。將樣品與緩沖液混合煮沸10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用半干電印跡系統轉移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂奶粉在TBST緩沖液(20 mmol/L Tris，166 mmol/L NaCl和0.05%吐溫-20，pH值為7.5)中封閉2 h后，用TBST緩沖液洗滌3次。4 ℃下加一抗抗體(1∶1 000)孵育過夜后，用TBST緩沖液洗滌3次，與辣根過氧化物結合的β-actin抗體(1∶2 000)在25 ℃下再孵育2 h，于在Chemi Doc XRS成像系統上檢測蛋白條帶。

2 結 果

2.1 二氫楊梅素對AGS細胞增殖的影響 二氫楊梅素為20、40和80 μmol/L時，細胞增殖率分別為61.7%、58.9%和40.7%，可見AGS細胞的增殖率隨二氫楊梅素濃度的升高而降低(圖1)。

與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖1 二氫楊梅素對AGS細胞活性的影響Fig.1 Effects of dihydromyricetin on proliferation of AGS cells

2.2 誘導細胞凋亡 凋亡細胞的數量與二氫楊梅素的濃度呈劑量依賴方式遞增，二氫楊梅素的濃度為80 μmol/L時，細胞的早期凋亡率為(8.22±1.22)%(右下象限)，顯著高于空白對照組(1.89±0.31)%；細胞的晚期凋亡率為(42.78±2.51)%(右上象限)，顯著高于空白對照組(4.92±0.77)%，具體見圖2。

圖2 二氫楊梅素對AGS細胞凋亡周期的影響Fig.2 Effects of dihydromyricetin on apoptosis cycle of AGS cells

2.3 二氫楊梅素對凋亡相關蛋白表達的影響 在二氫楊梅素處理的AGS細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低，Bcl-2/Bax的表達顯著降低(圖3A)。與空白對照組比較，經40和80 μmol/L的二氫楊梅素處理后，AGS細胞Bcl-2/Bax比值分別降低了16.5%和67.5%(圖3B)。

A：Western-blot實驗各蛋白的表達；B：Bcl-2/Bax；C：p-p38/p38；D：p-ERK/ERK。與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖3 二氫楊梅素對Bcl-2、Bax、p38和ERK蛋白水平的影響Fig.3 Effects of dihydromyricetin on Bcl-2, Bax, p38 and ERK protein levels

2.4 二氫楊梅素通過p38絲裂原活化蛋白激酶途徑影響細胞增殖和凋亡 將AGS細胞暴露于80 μmol/L二氫楊梅素中，與空白對照組比較，p-p38/p38蛋白的水平降低了78.6%(圖3C)，p-ERK/ERK蛋白的水平降低了81.5%(圖3D)。

2.5 誘導caspase介導的凋亡 在受試濃度的處理下，活化的caspase-3和caspase-9蛋白的表達均上調(圖4A)。在80 μmol/L的二氫楊梅素處理下，與空白對照組比較，cleaved caspase-3/caspase-3的表達從0.11提升到2.35，而cleaved caspase-9/caspase-9的表達從0.20提升到3.01(圖4B)。

A：Western-blot實驗各蛋白的表達；B：不同濃度二氫楊梅素處理AGS細胞后cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9的蛋白表達。與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖4 二氫楊梅素對活化的caspase-3和caspase-9表達水平的影響Fig.4 Effects of dihydromyricetin on cleaved caspase-3 and caspase-9 protein expressions

3 討 論

細胞凋亡是一種由基因介導的可自我調控的細胞死亡形式，與癌細胞的生長密切相關，也是治療癌癥的有效靶點之一[9-10]。細胞凋亡可通過內在或外在途徑觸發，導致癌細胞DNA片段化，抗癌藥物可通過激活外在或內在凋亡途徑殺傷癌細胞，大量的抗凋亡和促凋亡效應因子可對細胞凋亡起調節作用[11]。

胃癌的治療臨床上常采用多種方式進行聯合干預處理，如手術聯合放療或化療等。因化療具有較大的副作用，尋找高效低毒的化療藥物對胃癌的治療具有重要的意義。食源性多酚、黃酮類化合物因可通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，已成為癌癥治療研究的新熱點。Liu等[12]的研究報道，食源性多酚類化合物的珍珠梅黃酮可能通過ERK途徑誘導肝癌移植瘤細胞凋亡；Yang等[13]也報道，芹菜素能誘導肝癌細胞的自噬及凋亡。研究表明，二氫楊梅素可通過抑制相關癌基因和通路誘導癌細胞凋亡，如上調抑癌基因p53、激活信號傳導及轉錄激活蛋白3信號、下調蛋白激酶B(Akt)/Bad通路、抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達、調節核轉錄因子通路等[14-15]。亦有報道二氫楊梅素可通過p53通路誘導卵巢癌細胞凋亡和逆轉多藥耐藥[14]。可見二氫楊梅素的作用靶點多樣化，作用機制復雜，對胃癌細胞的增殖抑制作用是否也由凋亡途徑介導，目前尚不清楚。

本實驗在研究二氫楊梅素抑制胃癌細胞增殖作用的基礎上，探討其對細胞凋亡周期的影響和作用機制。研究結果顯示，在二氫楊梅素的處理濃度為10～80 μmol/L時，AGS細胞的增殖抑制效果及其凋亡數量與二氫楊梅素的濃度呈劑量依賴關系。同時，二氫楊梅素誘導的AGS細胞凋亡不僅與p38蛋白表達的改變有關，還伴隨Bax的過表達(細胞死亡的啟動子)。在細胞凋亡早期，Bax插入線粒體膜中并增加膜通透性，引導細胞色素C的釋放、多種caspase的激活以及下游死亡效應蛋白的裂解，進而誘發細胞凋亡程序的開啟。另外，經二氫楊梅素處理后的AGS細胞，在蛋白質水平觀察到Bax表達升高的同時伴隨Bcl-2表達的降低，這與早期報道[16]的抗癌類胡蘿卜素(多酚類化合物)的數據相似。近年來，通過誘導凋亡靶向清除AGS細胞已成為干預和預防胃癌的重要手段[7,9,12]。本研究還顯示，二氫楊梅素上調了活化的caspase-9和caspase-3蛋白表達，且差異性激活某些絲裂原活化蛋白激酶，包括p38、JNK和ERK的表達。眾所周知，ERK通路主要參與細胞增殖和分化，JNK和p38通路主要參與細胞應激反應和凋亡[10]。如Xu等[14]的研究顯示，75 μmol/L的二氫楊梅素對非小細胞肺癌的細胞增殖抑制效果顯著，機制是通過調控活性氧介導ERK/JNK的表達誘導癌細胞的凋亡，且二氫楊梅素對正常肺成纖維細胞無毒副作用。本研究結果表明，二氫楊梅素濃度為80 μmol/L時，可通過ERK和p38途徑抑制AGS細胞的增殖，其機制是通過上調活化的caspase-9和caspase-3蛋白表達，進而誘導AGS細胞凋亡。

綜上所述，二氫楊梅素作為一種結構簡單的小分子多酚類化合物，臨床和動物實驗均顯示其毒性低，且無交叉耐藥性[17]。二氫楊梅素抗癌作用多向，尤其在拮抗腫瘤細胞的耐藥性方面，起效濃度較低且抗耐藥作用顯著。另外，二氫楊梅素聯用抗腫瘤藥物具有良好的抗癌活性，具有一定的臨床應用價值。但作為小分子抗癌藥物，目前對二氫楊梅素的研究大多集中于體外藥效基礎，對體內藥效和藥物作用機制的研究較少，需進一步深入探討，以推動二氫楊梅素由基礎研究向臨床用藥轉化。