褪黑素對人胃癌細胞生長的影響

王日雄， 宋 軍， 劉 卉， 周瑞祥

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，表現為進展快、生存時間短、對常規化療反應差、患者預后差[1]。2018年，全球共有100多萬例胃癌病例，導致78.2萬人死亡。提高胃癌患者的生存率是目前臨床面臨的主要挑戰[2]。褪黑素是由松果腺分泌的吲哚胺類神經內分泌激素。研究表明，褪黑素通過促進腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制增殖、調節抗腫瘤免疫機制，對肝癌、乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤均有明顯的抑制作用[3-6]。本研究擬建立不同濃度及時間點褪黑素對不同分化狀態的人胃癌細胞株MGC-803、SGC-7901及AGS的干預模型，在氯化鈷(CoCl2)模擬乏氧條件下及常氧條件下，采用CCK-8、ELISA等方法檢測褪黑素對人胃癌細胞增殖活性及血管內皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 MGC-803、SGC-7901及AGS人胃癌細胞株由中國科學院上海生命科學研究院提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基、胰酶和胎牛血清(美國Gibco公司)；多聚賴氨酸、褪黑素與氯化鈷(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；VEGF ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.1.3 儀器 超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)；CO2孵育箱(美國Eppendorf公司)；微量移液器(美國Eppendorf公司)；倒置熒光相差顯微鏡(TE 2000-s，日本Nikon公司)；光學顯微鏡(XSP-C203，德國Olympus公司)；酶標儀(Model 550，美國Lab-Line公司)。

1.2 方法

1.2.1 褪黑素制備 稱取褪黑素(MW 232.2) 23.2 mg，用5 mL無水乙醇完全溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即成濃度0.02 mol/L母液，分裝后-80 ℃凍存。使用時室溫溶解后抽取500 μL母液，加入500 μL RPMI-1640培養基稀釋(終濃度為0.01 mol/L)。

1.2.2 褪黑素對人胃癌細胞干預研究的最佳濃度 取長至80%～90%匯合度的人胃癌細胞株MGC-803、SGC-7901及AGS，胰酶消化后按每孔5×103個細胞的密度分別接種于96孔板，每孔200 μL細胞培養液，18～20 h給予0.01、0.1、1及3 mmol/L不同濃度褪黑素干預，并設空白對照孔。分別在用藥0.5、2、16、24 h后吸棄培養液，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的新鮮培養液100 μL，37 ℃細胞培養箱內繼續孵育1 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度(OD)。每個濃度設6復孔，去除最高值和最低值后取平均值，實驗重復3次。按下列公式計算細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率=(各加藥孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(對照組吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100%

以抑制率和給藥時間為縱橫坐標繪制曲線。

1.2.3 光學顯微鏡觀察 將長至80%～90%匯合度的人胃癌細胞株SGC-7901以0.25%胰酶及0.1% EDTA進行消化，按每孔1×106個細胞的密度接種至6孔細胞培養板中。18～20 h(平皿中細胞80%～90%匯合)，用0.01、0.1、1、3 mmol/L不同濃度的褪黑素干預，并設空白對照組，24 h后置光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 CoCl2模擬乏氧條件下褪黑素對SGC-7901細胞生物學行為影響 取常氧條件下及100 μmol/L CoCl2模擬乏氧條件下對數生長期SGC-7901細胞，按每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，每孔 200 μL的細胞培養液，18～20 h給予 3 mmol/L褪黑素干預，并設空白對照孔，37 ℃細胞培養箱內繼續孵育。24 h后吸棄培養液，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的新鮮培養液100 μL，37 ℃細胞培養箱內繼續孵育1 h，450 nm處測定OD。每種濃度設6復孔，去除最高值和最低值后取平均值，實驗重復3次。

1.2.5 細胞分組 將常氧條件下及 100 μmol/L CoCl2模擬乏氧條件下處于對數生長期的人胃癌細胞株SGC-7901傳代后制成單細胞懸液，以每孔1×106的密度分別接種于6孔細胞培養板中，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱常規培養，18～20 h 給予褪黑素干預，分組如下：空白對照組及0.01、0.1、1、3 mmol/L MLT組，每種濃度設3個復孔，培養24 h。

1.2.6 ELISA檢測人胃癌細胞SGC-7901培養上清液VEGF-A蛋白的變化 將所有試劑室溫下平衡20 min，將待測的人胃癌細胞SGC-7901培養上清液10 000 r/min離心10 min后去除沉淀，建立標準曲線。加入待測樣品后，37 ℃恒溫箱反應 120 min，甩去板中樣品，拍干并加滿洗滌液，放置15～20 s后甩去，拍干，共洗5次。加入第一抗體工作液100 μL，37 ℃ 靜置60 min。加入親和鏈酶素-HRP，37 ℃ 靜置30 min。加顯色液A 50 μL，后加顯色液B 50 μL，放進37 ℃恒溫箱，避光顯色10 min。加入終止液50 μL，混勻，在 492 nm波長處測定各孔的OD值。采用酶標軟件Curve Expert 1.3繪制標準曲線，計算樣本中VEGF的含量。

2 結 果

2.1 褪黑素對人胃癌細胞增殖的抑制作用 1 mmol/L褪黑素作用0.5、2、16及24 h，細胞增殖活性成線性下降；3 mmol/L濃度組褪黑素作用24 h后，人胃癌細胞活性低，而0.01及0.1 mmol/L濃度組褪黑素對MGC-803、SGC-7901及AGS人胃癌細胞無明顯抑制增殖作用(圖1)，后繼實驗選擇3 mmol/L、24 h作為褪黑素的最佳作用濃度及藥物作用時間。

圖1 不同濃度和不同時間點褪黑素干預對MGC-803、SGC-7901及AGS細胞增殖的影響Fig.1 Effect of melatonin on MGC-803，SGC-7901，AGS cell proliferation in different concentrations and time points

2.2 乏氧條件褪黑素干預后SGC-7901胃癌細胞的形態學改變 1 mmol/L濃度褪黑素干預后，SGC-7901細胞數量明顯減少；3 mmol/L濃度褪黑素干預后，SGC-7901細胞不僅數量減少，且細胞觸角開始縮短，細胞變圓，部分細胞飄浮(圖2)。

A：0 mmol/L+乏氧；B：1 mmol/L+乏氧；C：3 mmol/L+乏氧。圖2 乏氧條件下1、3 mmol/L褪黑素干預后SGC-7901胃癌細胞的形態學改變( ×200)Fig.2 Morphological changes of SGC-7901 gastric cancer cell after intervention with 1 mmol/L and 3 mmol/L melatonin in the normoxic condition( ×200)

2.3 乏氧條件下褪黑素干預對SGC-7901細胞生物學行為的影響 100 μmol/L CoCl2模擬乏氧條件下，0.5、2、16及24 h后細胞增殖活性成線性上升，3 mmol/L濃度褪黑素作用24 h后，無論常氧及乏氧條件下SGC-7901細胞增殖活性均成線性下降，且細胞活性很低(圖3)。

與0.5 h比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.05。圖3 氯化鈷模擬乏氧條件下褪黑素對SGC-7901細胞增殖的影響Fig.3 Effect of melatonin on SGC-7901 cell proliferation in the hypoxic condition simulated by cobalt chloride

2.4 褪黑素對SGC-7901細胞上清液VEGF-A濃度的影響 與空白對照組比較，常氧與乏氧條件下使用3 mmol/L 褪黑素處理24 h后，SGC-7901細胞上清液VEGF-A蛋白表達顯著下調，差別有統計學意義(P<0.05)；而缺氧條件下VEGF-A下降更為明顯(圖4)。

VEGF-A：血管內皮生長因子-A。與對照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.05。圖4 褪黑素對SGC-7901細胞VEGF-A分泌的影響Fig.4 Effect of melatonin on VEGF-A secretion from SGC-790 cells

3 討 論

研究證實，褪黑素由于具有強大的免疫調節功能、抗增殖效應、抗氧化和抗血管新生效應[7-9]，褪黑素體外能夠抑制多種腫瘤細胞株增殖，如乳腺癌細胞株、卵巢癌細胞株、肝細胞癌株、結腸癌細胞株、前列腺癌細胞株等[10-12]。本研究結果發現，低濃度褪黑素(0.01、0.1 mmol/L)對人胃癌細胞株MGC-803、SGC7901及AGS無明顯抑制作用，而高濃度褪黑素(1、3 mmol/L)能明顯抑制人胃癌細胞株的增殖，且呈時間和劑量依賴趨勢。3 mmol/L褪黑素在體外抑制人胃癌細胞增殖作用最為顯著。

惡性腫瘤生長過程中，當腫瘤直徑超過1 mmol/L時，原有的血管已經不能滿足腫瘤自身生長的需要，必須通過新生的微血管提供氧和營養物質。而新生的血管擴張、內皮細胞和基底膜的完整性，影響氧和營養物質的運輸，形成慢性彌散障礙的低氧環境[13]。腫瘤血管形態學的改變也造成血管痙攣，造成急性或慢性灌注不足性低氧。因此，缺氧是實體瘤微環境的基本特征之一[14]，在體外制造微缺氧的細胞培養環境，對研究微缺氧對腫瘤細胞生長的影響及微缺氧狀態下藥物對腫瘤細胞的作用具有重要意義。通常通過注入低氧氣體來實現體外微缺氧細胞培養模型，但較為煩瑣。研究證實，低氧環境可由CoCl2模擬[15-16]。本研究采用100 μmol/L濃度CoCl2模擬胃癌細胞的缺氧環境。CCK-8檢測結果顯示，SGC-7901胃癌細胞的增殖活性明顯增強，表明胃癌細胞在缺氧時啟動了低氧適應機制，產生了特殊的細胞增殖現象，但應用3 mmol/L褪黑素干預可明顯抑制SGC-7901細胞的增殖，其對細胞的毒性作用呈時間-劑量依賴性。

血管生成是胃癌發生、發展的前提[17]，腫瘤細胞分泌的VEGF、肝細胞生長因子、表皮生長因子和轉化生長因子、血小板衍生因子、白細胞介素、干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、胎盤生長因子等多種促血管生長因子中，VEGF是最有效的促血管生長因子，共通過與其靶細胞表面的VEGFR結合刺激血管內皮細胞增殖促進腫瘤微血管的生長[18-19]。研究發現，癌細胞系存在VEGF的自分泌信號，癌細胞自分泌產生的VEGF與自身受體VEGFR結合，使之發生磷酸化，促進癌細胞自身生長和維持細胞系侵襲表型，這一作用可能獨立于其促血管生成的旁分泌作用。這些結果均表明，癌細胞存在VEGF的自分泌信號，且通過VEGF/VEGFR自分泌環調節腫瘤細胞增殖、侵襲與凋亡[17,20-22]。筆者檢測了褪黑素對人胃癌SGC-7901細胞及細胞上清液VEGF-A蛋白表達的影響，結果發現，褪黑素干預可抑制SGC-7901細胞中VEGF-A蛋白的分泌，并呈劑量依賴性。因此，筆者認為，抑制人胃癌細胞SGC-7901 VEGF-A的自分泌作用可能是褪黑素抑制SGC-7901細胞增殖作用的機制之一。