小鼠腹腔手術睪丸注射抑制模型的建立

鄒高煥， 許孟飛， 唐雅君， 江孫穎， 鄭舒敏， 楊宇豪， 魏雅嵐， 佘振宇

生殖生物學是生命科學的重要研究領域，是研究生殖活動及其基本規律的自然科學。WHO報告表明，不孕不育癥已成為僅次于腫瘤和心血管疾病的第三大疾病。全球有4 800萬對夫婦和1.86億人患有不孕不育癥。我國每8對育齡夫婦中有1對患不孕不育癥，發病率為12.5%～15.0%。約30%的不孕不育癥由男性不育導致，其中7%為精子質量問題，包括無精子癥、少精子癥、弱精子癥和精子無力癥等[1]。生精功能異常、染色體數目和結構異常是男性不育癥的主要原因[2]。

精子發生包括精原細胞增殖、精母細胞減數分裂和精子形成等階段[3]。減數分裂對同源染色體分離、染色體穩定性與生育能力維持至關重要。小鼠是生殖生物學常用的動物模型之一[4]，其減數分裂起始于10 d齡。但2～3周齡小鼠的睪丸未沉降至陰囊，無法直接注射抑制劑或藥物。早期小鼠睪丸抑制模型和減數分裂相關研究較為困難。本研究擬通過小鼠腹腔手術和睪丸生精小管注射法，實現睪丸內蛋白抑制，建立一種高效且簡便的雄性減數分裂研究模型，為生殖生物學研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級20～30 g ICR雄性小鼠(3周齡)，由福建醫科大學動物實驗中心提供[動物生產許可證號：2015000519041，實驗動物許可證號：SYXK(閩)2016-0007]。

1.1.2 實驗材料 Eg5抑制劑Dimethylenastron母液(200 mmol/L，MedChemExpress，貨號：HY-19944)；切片石蠟、蘇木精溶液、伊紅、鹽酸、乙醇、二甲苯、碳酸鋰、中性樹膠、恒溫水浴鍋(DK-S22，上海精宏實驗設備有限公司)；石蠟超薄切片機(RM2235，德國Leica公司)；光學顯微鏡(Ti-S2，日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 術前準備 小鼠術前1 h斷食斷水。手術器械、1 × 磷酸鹽緩沖液、槍頭等物品高溫高壓滅菌(121 ℃，30 min)。

1.2.2 小鼠麻醉、固定及備皮 右手抓取小鼠尾部，置于籠蓋上方，左手拇指與示指抓住小鼠頸背部皮膚。拎起后左手環指按住左腿，小指抓住鼠尾及右腿。腹中線處以30°～60°進針，深度不超過1 cm。進針后局部皮膚凹陷消失，并有落空感，回抽未見血后行腹腔注射10%水合氯醛，劑量為50 μL/10 g體質量[5]。注意不要刺入過深損傷內臟，或只進入皮下而未進入腹腔。麻醉完全后捆綁小鼠四肢，仰臥位固定于蠟盤，行下腹部至尿道口備皮。

1.2.3 腹腔手術 右手執筆式持手術刀，左手拇指和食指繃緊切口上端兩側皮膚，取下腹部正中切口逐層切開。保持切口5～10 mm，內外大小一致，充分暴露手術野。

1.2.4 睪丸注射 手術鑷夾住小鼠外皮層，牽拉脂肪體，可見腹部兩側睪丸(特征為淡黃色，分布有紅色睪丸動脈袢)，輕夾至體外。鑷子固定睪丸，注射器穿刺進行睪丸注射。緩慢注射后停留5 s拔出注射器，使藥物通過生精小管擴散至整個睪丸(圖1)。將50只小鼠隨機分為對照組和實驗抑制組。對照組注射10 μL 0.05%臺盼藍或磷酸鹽緩沖液，實驗抑制組注射10 μL 0.075% Dimethylenastron抑制劑。

A：腹部正中線腹部開口1 cm；B：逐層切開皮膚、筋膜層、腹膜；C：用鑷子夾取睪丸至體外；D：使用1 mL注射器注射藥物。圖1 小鼠腹腔手術和睪丸生精小管注射的關鍵步驟Fig.1 Key steps of intraperitoneal surgery and testicular seminiferous tubule injection in mice

1.2.5 手術傷口縫合及術后護理 注射完成后，將睪丸輕推回腹腔，單純間斷縫合。苦味酸標記不同實驗組小鼠，放回鼠籠，注意術后保暖和護理。

1.2.6 組織包埋、H-E染色和形態學觀察 小鼠麻醉，切開腹腔，手術剪分離睪丸。睪丸經10%甲醛水溶液固定18 h，50%乙醇30 min，70%乙醇40 min，85%乙醇40 min，95%乙醇50 min，100%乙醇50 min，二甲苯30 min。65 ℃石蠟浸泡90 min，石蠟室溫包埋過夜。超薄切片機行5 μm超薄切片，40 ℃水浴鍋展片，37 ℃干燥24 h備用。

石蠟切片經無水乙醇6 min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min。Mayer’s蘇木素染色5 min，自來水5 min，蒸餾水2 min。1%鹽酸乙醇溶液分色3 s后自來水洗3 min。碳酸鋰飽和溶液返藍1 min，蒸餾水洗2 min。1%伊紅溶液5 min，95%乙醇脫水10 s，100%乙醇脫水3 min，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。

2 結 果

小鼠共50只，術后死亡3只，存活率為94.0%，表明腹腔手術睪丸注射模型的小鼠存活率較高。術后小鼠的腹部切口完全愈合，無感染癥狀，生存狀態良好。對照組和實驗抑制組的小鼠體質量、小鼠睪丸質量、睪丸質量/體質量比比較，差別無統計學意義(P>0.05)。對照組和實驗抑制組的小鼠睪丸長徑分別為(0.68±0.01)和(0.73±0.02)cm，差別有統計學意義(P<0.05,圖2)。兩組小鼠睪丸的外形均完整，形態正常且無明顯差異。對照組和實驗抑制組小鼠睪丸的質量分別為(79.19±4.80)和(85.00±4.39)mg(圖2)，表明Dimethylenastron抑制劑注射對睪丸質量無明顯影響。

石蠟切片和H-E染色可見，實驗抑制組的睪丸生精小管內處于減數分裂的精母細胞數量增加，減數分裂中期染色體排列紊亂，部分染色體無法整齊排列。統計分析發現，Eg5抑制后生精小管的中期阻滯精母細胞數比例為(12.81±1.12)%，而對照組為(0.18±0.12)%，差別有統計學意義(P<0.05,圖2)，表明Dimethylenastron介導的Eg5蛋白抑制導致精母細胞中期停滯，細胞周期停滯和減數分裂染色體排列異常。

A：小鼠體質量比較；B：小鼠睪丸質量比較；C：睪丸質量/體質量比比較；D：小鼠睪丸長徑比較；E：對照組生精小管(H-E染色 ×40)；F：Eg5抑制組生精小管(H-E染色 ×40)；G：中期停滯精母細胞比例比較。圖2 小鼠睪丸內Eg5抑制導致精母細胞中期停滯和減數分裂染色體排列異常Fig.2 Eg5 inhibition in mouse testes led to spermatocyte metaphase arrest and abnormal meiotic chromosome alignment

3 討 論

本研究介紹了腹腔手術進行睪丸注射模型的建立過程，通過腹腔手術成功實現Dimethylenastron介導的Eg5蛋白抑制，完成對小鼠睪丸內Eg5蛋白的抑制和減數分裂的相關研究，驗證了實驗模型的可行性。本研究具有以下優點：(1)不受小鼠年齡限制，可對2～3周齡小鼠的未沉降睪丸進行抑制劑注射，完成精子發生早期減數分裂的功能及機制研究。(2)可實現精準注射，避免因睪丸表面血管破裂出血或睪丸貫穿傷造成睪丸壞死。(3)腹腔手術睪丸注射可準確控制藥物用量，添加臺盼藍指示劑可輔助注射實驗和提高手術效率。(4)對生殖系統傷害較小，且陰囊壁完整。

小鼠是最典型的模式動物之一，使用也最為廣泛。因此，小鼠睪丸注射抑制模型的建立對減數分裂及睪丸的研究提供了技術參考。既往的研究多采用直接經陰囊注射藥物，操作簡便、創口小，但易出血且無法判斷藥物是否注入睪丸內及是否造成睪丸貫穿傷，存在多種不確定因素[6-7]。此外，還有睪丸網注射和睪丸間質注射等方法[8]。上述注射法在睪丸兩側作切口，暴露睪丸進行注射。睪丸網注射需在顯微鏡下操作，對實驗人員技術操作要求高；而睪丸間質注射對睪丸機械損傷過大，穿孔較多。上述幾種方法均對睪丸及陰囊壁造成不同程度的損傷。傳統陰囊注射法要求實驗小鼠的睪丸沉降至陰囊，

一般需要鼠齡超過4周齡，對實驗限制多，不利于減數分裂等精子發生的早期相關研究。另外，傳統陰囊直接注射法較難保證注射的準確性，而腹腔手術睪丸注射法可保證注射位置的準確性和觀察藥物的擴散程度。不同的實驗操作手法及選用不同試劑，對睪丸損傷程度尚無定論[8]。

小鼠腹腔手術睪丸注射實驗模型仍存在一些需要關注的問題：小鼠麻醉劑的選擇及其劑量；小鼠腹壁腹膜較薄，行腹腔手術時易傷及血管臟器，引發出血，污染手術野和導致術后感染，使小鼠存活率降低。腹腔手術臟器暴露時間與小鼠感染幾率存在一定相關性，能否快速找到睪丸是本實驗的難點，且縫合不當易引起術后腹膜粘連等問題[9]，因此，要求實驗人員熟練掌握各步驟方法。在小鼠腹腔手術過程，手術切口的位置選擇在尿道口上方5 mm處，通過輕輕牽拉脂肪體定位睪丸和體視顯微鏡輔助觀察，可加快尋找睪丸的速度和提高注射的精確性。在實驗模型建立過程中，提高無菌操作技術、減少傷口大小、術后合理使用抗菌藥物和加強術后護理，有助于提高手術安全性，減少術后并發癥和提高小鼠術后存活率及實驗成功率。