瑞芬太尼通過抑制氧化應激減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷

李麗珍， 鐘煒昕， 詹根明， 林 芩

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)可影響肝臟手術后的肝功能和肝組織再生，引起術后肝功能異常、原發性移植肝無功能，甚至多器官功能衰竭，增加患者肝功能衰竭的發生率和死亡率[1-2]。目前認為，大量氧自由基生成是發生HIRI的主要機制之一。肝臟缺血再灌注后，可大量產生氧自由基，引發肝臟氧化應激反應，不僅可通過氧化細胞的膜性結構產生脂質過氧化反應損傷細胞，還可通過氧化核酸酶破壞DNA雙鏈結構導致細胞死亡，從而造成HIRI;瑞芬太尼后處理可減輕心肌、腦等組織器官的缺血再灌注損傷[3-7]。然而，目前國內外關于瑞芬太尼后處理是否對HIRI有保護作用的報道較少，其具體保護機制也尚未闡明。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)的生理作用廣泛，可在應激條件下(如高溫、缺血、缺氧等)誘導合成，通過減輕機體或組織的氧化應激反應，產生細胞保護作用[8-9]。動物實驗研究發現，HSP70可直接或間接保護肝臟切除術后大鼠的肝功能和肝組織再生，提高大鼠的存活率[10-11]。本研究擬探討瑞芬太尼后處理是否可增強HSP70的表達和減輕大鼠HIRI，并通過設立HSP70抑制劑槲皮素對照組，進一步求證HSP70在瑞芬太尼后處理減輕大鼠HIRI中的作用，從而闡明瑞芬太尼后處理減輕HIRI的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級成年健康雄性SD大鼠24只[許可證號：SCXK(滬)2017-0005，上海斯萊克實驗動物有限責任公司]，體質量300 g，鼠飼料喂飼，術前禁食12 h，自由飲水。

1.1.2 試劑和儀器 注射用瑞芬太尼(批號：國藥準字H20030197，宜昌人福藥業有限責任公司)；槲皮素(批號：R006828，上海易恩化學技術有限公司)；丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase，ALT)測定試劑盒(批號：S03030)和天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒(批號：S03040)(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(批號：A001-1)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(批號：A003-1)(南京建成生物工程研究所)；β-actin鼠單抗(GB12001，武漢賽維爾生物科技有限公司)；HSP70兔單抗(AF1156，上海碧云天生物技術有限公司)。酶標檢測儀(Epoch，美國BioTeK公司)；光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100，日本尼康公司)；灰度分析軟件(AlphaEaseFC，美國Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠HIRI模型 根據本研究團隊前期建立大鼠70% HIRI模型的方法[12-13]，在支配大鼠肝左中葉的肝動脈、門靜脈和膽管分支下方穿一條4-0線，可逆性結扎阻斷肝臟左中葉血流45 min，松開可逆性結扎線再灌注3 h。

1.2.2 分組 根據隨機數字表法將大鼠分為4組(n=6)：假手術組(S組)、HIRI組(I/R組)、瑞芬太尼組(R組)和槲皮素組(Q組)。S組：在大鼠肝左中葉的肝動脈、門靜脈和膽管分支下方只穿一條4-0線而不進行可逆性結扎，余操作同大鼠HIRI模型建立方法；I/R組：按照大鼠HIRI模型建立方法，行缺血45 min再灌注3 h；R組：于再灌注開始10 min內靜脈推注瑞芬太尼4 μg/kg，余操作同I/R組；Q組：于再灌注開始10 min內先給予槲皮素7 mg/kg，再給予瑞芬太尼4 μg/kg，余操作同R組。

1.2.3 檢測血清ALT和AST活性 再灌注3 h后，大鼠開腹取腹主動脈血3～4 mL，促凝離心留取上清液待測。采用全自動生化儀按照試劑盒說明書測定血清ALT和AST活性。

1.2.4 觀察肝組織病理形態學并測定SOD活性、MDA和HSP70含量 切取左中葉的肝組織，一部分切片行H-E染色，光鏡下觀察肝組織的病理形態學變化；一部分制備肝組織勻漿，按照試劑盒說明書檢測肝組織的SOD活性和MDA含量；一部分采用Western-blot法，以β-actin鼠單抗和HSP70兔單抗檢測HSP70蛋白表達，經組織總蛋白提取、BCA法測定總蛋白濃度、蛋白變性、電泳、轉膜、免疫反應、化學發光，獲得凝膠圖像。采用Alpha Ease FC軟件處理系統分析條帶的灰度值，計算各樣本的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值(表示各樣本肝組織的HSP70含量)。

2 結 果

2.1 大鼠血清ALT和AST活性 I/R組、R組和Q組血清ALT和AST活性均顯著高于S組(P<0.05)；R組顯著低于I/R組(P<0.05)；Q組和I/R組差別無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 大鼠血清ALT和AST活性

2.2 肝組織病理形態學變化 肝組織經H-E染色后，光鏡下可見，S組肝小葉為正常結構，中央靜脈居中，肝細胞形態飽滿，肝細胞索呈放射狀整齊排列；I/R組和Q組肝小葉失去正常結構，中央靜脈擴張，血管腔內淤積較多紅細胞，肝細胞索排列紊亂，失去放射狀，部分肝細胞出現空泡；R組仍可見中央靜脈腔內有紅細胞淤積，但肝小葉尚保持較正常結構，肝細胞索尚可見放射狀排列，肝細胞較少出現空泡(圖1)。

A、B：假手術組，肝小葉為正常結構，肝細胞形態飽滿，肝索放射排列；C、D、G、H：C、D為HIRI組，G、H為槲皮素組，肝小葉失去正常結構，中央靜脈腔擴張并有較多紅細胞淤積，部分肝細胞出現空泡；E、F：瑞芬太尼組，肝小葉尚保持較正常結構，中央靜脈腔內紅細胞淤積和肝細胞內空泡較少。圖1 光鏡下大鼠肝組織H-E染色病理形態學變化Fig.1 Pathomorphological changes of H-E staining of rat liver under light microscope

2.3 肝組織SOD活性及MDA和HSP70含量 I/R組和Q組肝組織SOD活性顯著低于S組，而R組顯著高于S組(P<0.05)。I/R組、R組和Q組肝組織MDA和HSP70含量均顯著高于S組(P<0.05)。R組肝組織SOD活性和HSP70含量顯著高于I/R組，而MDA含量顯著低于I/R組(P<0.05)。Q組與I/R組肝組織SOD活性及MDA和HSP70含量差別均無統計學意義(P>0.05，表2，圖2)。

表2 大鼠肝組織SOD活性及MDA、HSP70含量

HSP70:熱休克蛋白70。A:Western-blot法檢測;B：灰度比值分析。S：假手術組；I/R：HIRI組；R：瑞芬太尼組；Q：槲皮素組。與S組比較，☆：P<0.05；與I/R組比較，#：P<0.05。圖2 Western-blot法檢測大鼠肝組織HSP70表達Fig.2 The protein expression of HSP70 in rat liver detected by Western-blot

3 討 論

血清ALT和AST活性可敏感地反映急性肝損傷。本研究顯示，I/R組血清ALT和AST活性明顯高于S組，提示大鼠發生了急性肝損傷。光鏡下，I/R組肝小葉失去正常結構，中央靜脈擴張，血管腔內有較多紅細胞淤積，肝細胞索排列紊亂，失去放射狀排列，部分肝細胞出現空泡，說明大鼠HIRI模型建立成功。

HIRI機制復雜，其中氧自由基損傷是其重要的機制之一。HIRI時，肝組織中產生大量氧自由基，攻擊生物膜，增強膜脂質過氧化，生成大量脂質過氧化產物MDA，從而造成細胞損傷。而生物體內重要的抗氧化酶SOD，被稱為天然的氧自由基清除劑，可清除氧自由基，減輕細胞的脂質過氧化損傷。因此，MDA和SOD的高低常被用來反映機體或組織的氧化應激水平。本研究結果顯示，I/R組肝組織MDA含量比S組升高，而SOD活性比S組降低，表明HIRI時，肝組織的膜脂質過氧化反應增強，從而使MDA含量升高，而SOD則因清除肝組織內氧自由基而消耗導致其活性降低。

藥物后處理是指通過藥物干預減輕長時間缺血后的器官或組織的缺血再灌注損傷，一般于再灌注前或再灌注開始的幾分鐘內進行干預。瑞芬太尼是目前臨床上常用的超短效、強效的阿片類麻醉鎮痛藥，起效快，代謝快，長時間使用不易產生藥物蓄積，且代謝不受肝腎功能影響。肝臟手術通常時間較長，且患者常合并肝功能不全，因此在肝臟手術麻醉中應用瑞芬太尼具有一定優勢。王建珍等[14]對HIRI大鼠在再灌注開始時給予瑞芬太尼后處理，發現大鼠血清中的AST、ALT活性和白細胞介素-8濃度均降低，肝細胞的c-fos和c-jun表達均下調，肝組織病理學損傷減輕。本研究結果與上述文獻一致。本研究中，R組于再灌注開始的10 min內給予瑞芬太尼后處理，再灌注3 h后，與I/R組比較，其血清ALT、AST活性和肝組織MDA含量均降低，肝組織SOD活性升高，肝組織病理形態學損傷減輕，表明瑞芬太尼后處理減輕了HIRI引起的急性肝損傷和脂質過氧化，抑制了氧化應激反應。

有研究報道，肝臟發生HIRI時，肝組織中HSP70表達升高，高表達的HSP70可發揮重要的肝臟保護作用[15-16]。本研究結果顯示，I/R組、R組和Q組大鼠肝組織的HSP70含量均顯著高于S組，證明了HIRI時肝組織中HSP70表達升高。本研究還發現，R組肝組織的HSP70含量顯著高于I/R組，表明瑞芬太尼后處理可增強肝組織HSP70的表達；同時，R組肝組織的SOD活性也顯著高于I/R組，而MDA含量卻低于I/R組，原因可能是：HSP70不僅可抑制氧自由基的產生，還能增加內源性SOD的產生，增強SOD的活性，提高機體清除氧自由基的能力，從而減輕脂質過氧化，抑制機體的氧化應激反應[17-18]。為進一步證實瑞芬太尼后處理可通過增強HSP70的表達減輕HIRI，本研究設計了Q組，在瑞芬太尼后處理之前給予槲皮素，具體劑量見文獻[13]。槲皮素是HSP70的抑制劑，可通過在轉錄水平抑制熱休克轉錄因子的磷酸化下調HSP70的表達[19]。本研究中，Q組肝組織HSP70含量與I/R組差別無統計學意義，血清ALT、AST和肝組織SOD活性及MDA含量與I/R組差別也無統計學意義，肝組織病理形態學損傷相似，說明槲皮素使肝組織HSP70的表達減少，消除了瑞芬太尼后處理減輕HIRI的作用。由此可見，瑞芬太尼后處理減輕HIRI的作用機制與增強肝組織HSP70表達有關。

綜上所述，瑞芬太尼后處理可減輕大鼠HIRI，減輕脂質過氧化，抑制氧化應激反應，這一作用與增強肝組織HSP70的表達有關。