Exendin-4對棕櫚酸介導的胰島β細胞TLR4/JNK/Bax通路的干預作用

江 震， 沈喜妹， 楊立勇

脂毒性在2型糖尿病的發病機制中起重要作用。長期暴露于高水平的游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)，如棕櫚酸(palmitic acid，PA)，可損害胰島β細胞功能，干擾細胞代謝途徑，誘導胰島β細胞凋亡[1]。本課題組前期研究顯示，PA主要通過激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導β細胞損傷[2-3]，導致細胞凋亡、胰島素分泌障礙，但TLR4的下游靶信號有待進一步明確。艾塞那肽(Exendin-4)是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的類似物，在治療糖尿病方面擁有很好的應用前景。Exendin-4可通過促進β細胞增殖、抑制β細胞凋亡改善β細胞的功能。本研究擬探討TLR4下游信號c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)/Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)通路在PA介導的胰島β細胞損傷過程中所起的作用，并探討應用Exendin-4的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：小鼠胰島素瘤細胞系βTc6購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。(2)試劑：DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶(美國Gibco公司)；PA、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、SP600125(美國Sigma公司)；TLR4阻滯劑CLI-095(美國Invitrogen公司)；TLR4激動劑LPS和JNK激動劑anisomycin(上海皓元生物醫藥科技有限公司)；Exendin-4(以色列ProSpec-Tany公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；TLR4、JNK、p-JNK、Bax、Bcl-2、β-actin(美國Santa Cruz公司)；二抗抗體及Western-blot相關試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組

1.2.1.1 細胞培養 使用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養細胞，生長至對數生長期后，將細胞分為對照組(無血清培養基)、BSA組(0.5% BSA)和PA組(0.5 mmol/L的PA)，干預時間為24 h。

1.2.1.2 藥物干預

1.2.1.2.1 TLR4或JNK阻滯劑干預試驗 進入對數生長期的細胞分為對照組(無血清培養基培養24 h)、PA組(0.5 mmol/L的PA干預24 h)、CLI-095組(3 μmol/L CLI-095處理細胞24 h)、SP600125組(25 μmol/L SP600125處理細胞24 h)、PA+CLI-095組(3 μmol/L CLI-095預處理細胞4 h，再予CLI-095+PA處理細胞24 h)和PA+SP600125組(25 μmol/L SP600125預處理細胞4 h，再予SP600125+PA處理細胞24 h)。

1.2.1.2.2 Exendin-4干預試驗 進入對數生長期的細胞分為對照組(無血清培養基培養24 h)、PA組(0.5 mmol/L的PA干預24 h)、Exendin-4組(50 nmol/L Exendin-4干預24 h)和Exendin-4+PA組(50 nmol/L Exendin-4預孵育細胞24 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)。

1.2.1.2.3 TLR4、JNK激動劑或阻滯劑對Exendin-4干預試驗 進入對數生長期的細胞分為對照組(無血清培養基培養24 h)、CLI-095組(3 μmol/L CLI-095處理細胞24 h)、SP600125組(25 μmol/L SP600125處理細胞24 h)、LPS組(10 mg/L LPS干預24 h)、anisomycin組(10 μmol/L anisomycin干預24 h)、Exendin-4+PA組(50 nmol/L Exendin-4預孵育細胞24 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)、CLI-095+Exendin-4+PA組(3 μmol/L CLI-095處理細胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)、SP600125+Exendin-4+PA組(25 μmol/L SP600125預處理細胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)、LPS+Exendin-4+PA組(10 mg/L LPS預處理細胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)、anisomycin+Exendin-4+PA組(10 μmol/L anisomycin預處理細胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預24 h)。

1.2.2 葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)βTC6細胞接種于6孔板中培養至對數生長期，經各種實驗因素干預特定時間后，吸棄培養液，用無糖克-林二氏重碳酸鹽緩沖液(KRBB)(pH值為7.4)洗滌2遍后，用37 ℃無糖KRBB 1 mL預處理30 min，吸棄KRBB，再洗滌細胞1遍，每孔加入37 ℃ KRBB(20 mmol/L葡萄糖)孵育刺激細胞60 min，收集細胞上清，-20 ℃保存備用。

1.2.3 ELISA測定細胞上清液中胰島素水平 取100 μL樣品稀釋液、100 μL各濃度標準品至包被抗體的96孔板微孔中，覆蓋封板膜，37 ℃孵育2 h；移除各孔中液體，移液槍吸取100 μL生物素標記抗體工作液加入各微孔中，覆蓋封板膜，37 ℃孵育1 h；吸取上清液，取300 μL 稀釋好的洗滌液至各微孔中，靜置1～2 min后，移除洗滌液，重復操作3次；移液槍吸取100 μL辣根過氧化物酶標記親和素工作液加至各微孔中，覆蓋封板膜，于37 ℃中孵育1 h；重復上述洗滌操作5次；取90 μL TMB底物溶液至各微孔，避光操作。在37 ℃中孵育20 min，移液槍吸取50 μL終止液至各微孔中，使液體變黃。反應終止后5 min內在450 nm波長酶標儀中檢測各管OD值，并記錄相應數據。裂解上述細胞，按照Trizol及BCA蛋白定量試劑盒說明書提取總蛋白，紫外分光光度計562 nm處檢測蛋白量。

1.2.4 Western-blot檢測蛋白表達 細胞內加入RIPA 200 μL和PMSF 2 μL，冰上裂解后吸取上清液，用BCA法進行蛋白定量。取40 μL蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，與抗體TLR4(sc-8694，1∶1 000)、JNK(sc-571，1∶500)、p-JNK(sc-6254，1∶500)、Bax(sc-6236，1∶500)、Bcl-2(sc-7832，1∶500)或β-actin(sc-47778，1∶1 000)4 ℃孵育過夜。洗膜后，取膜與稀釋后的二抗(1∶5 000)室溫搖晃1 h，ECL化學發光系統顯色，凝膠成像分析系統進行分析。

2 結 果

2.1 PA對β細胞胰島素分泌及TLR4/JNK/Bax信號表達的影響 PA干預βTC6細胞24 h后，βTC6細胞的GSIS水平降低(P<0.05)，同時TLR4、p-JNK、Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax下降(P<0.05，表1，圖1)。

表1 PA對β細胞胰島素分泌及相關蛋白表達的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌；BSA：牛血清白蛋白；PA：棕櫚酸。A：PA對胰島素分泌的作用；B：蛋白質印跡法檢測蛋白表達；C：PA對TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達的作用。與對照組比較，☆：P<0.05。圖1 PA對β細胞胰島素分泌及TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達的作用Fig.1 The effect of PA on the insulin secretion and protein expression of TLR4，JNK，Bax and Bcl-2 in β cell

2.2 TLR4及JNK抑制劑對PA作用的影響 抑制TLR4活性，可拮抗PA引起的GSIS障礙(P<0.05)，下調Bax蛋白表達(P<0.05)，并上調Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax(P<0.05)；抑制JNK活性，亦可拮抗PA的上述損害作用(P<0.05，表2，圖2)。

表2 TLR4及JNK抑制劑對PA引起的β細胞胰島素分泌及相關蛋白表達的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌。1：對照組；2：PA組；3：CLI-095組；4：SP600125組；5：PA+CLI-095組；6：PA+SP600125組。A：TLR4及JNK抑制劑對胰島素分泌的作用；B：蛋白質印跡法檢測蛋白表達；C：TLR4及JNK抑制劑對Bax、Bcl-2蛋白表達的作用。與對照組比較，☆：P<0.05；與PA組比較，#：P<0.05。圖2 TLR4及JNK抑制劑對PA引起的β細胞胰島素分泌及Bax、Bcl-2蛋白表達的作用Fig.2 The effect of TLR4 and JNK inhibitors on the insulin secretion and protein expression of Bax and Bcl-2 induced by PA in β cell

2.3 Exendin-4對PA作用的影響 Exendin-4干預可改善PA誘導的β細胞GSIS障礙(P<0.05)，下調TLR4、p-JNK、Bax蛋白表達水平(P<0.05)，并上調Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax(P<0.05，表3，圖3)。

表3 Exendin-4對PA引起的β細胞胰島素分泌及相關蛋白表達的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌。A：Exendin-4對胰島素分泌的作用；B：蛋白質印跡法檢測蛋白表達；C：Exendin-4對TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達的作用。與對照組比較，☆：P<0.05；與PA組比較，#：P<0.05。圖3 Exendin-4對PA引起的β細胞胰島素分泌及TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達的作用Fig.3 The effect of Exendin-4 on the insulin secretion and protein expression of TLR4, JNK, Bax and Bcl-2 induced by PA in β cell

2.4 調控TLR4或JNK活性對Exendin-4干預脂毒性β細胞胰島素分泌作用的影響 抑制TLR4/JNK活性可增加Exendin-4改善脂毒性β細胞GSIS障礙的作用；反之，增強TLR4/JNK活性可削弱Exendin-4改善脂毒性β細胞GSIS障礙的作用(P<0.05，表4，圖4)。

表4 TLR4或JNK的激動劑和抑制劑對Exendin-4干預脂毒性β細胞胰島素分泌的影響

1：對照組；2：CLI-095組；3：SP600125組；4：LPS組；5：anisomycin組；6：Exendin-4+PA組；7：CLI-095+Exendin-4+PA組；8：SP600125+Exendin-4+PA組；9：LPS+Exendin-4+PA組；10：anisomycin+Exendin-4+PA組。TLR4激動劑和JNK激動劑及TLR4阻滯劑和JNK阻滯劑對Exendin-4干預脂毒性β細胞胰島素分泌的作用。與對照組比較，☆：P<0.05；與Exendin-4+PA組比較，#：P<0.05。圖4 調控TLR4或JNK活性對Exendin-4干預脂毒性β細胞胰島素分泌的作用Fig.4 Regulating the activity of TLR4 or JNK affected the protective role of Exendin-4 on the insulin secretion of lipotoxic β-cells

3 討 論

糖尿病患病率不斷飆升，肆虐人類健康，而延緩胰島β細胞功能持續惡化是當今防治糖尿病的主要策略。研究顯示，脂毒性是誘導β細胞胰島素分泌功能失代償和衰竭的重要機制[4]。本課題組前期研究證實，脂毒性誘導的代謝性炎癥是代謝壓力引起β細胞功能衰退的關鍵病理機制，但尚缺乏特異干預措施[5]。

代謝性炎癥是胰島β細胞對糖脂代謝應激的適應性反應，但持續的代謝免疫失衡可不斷削弱β細胞的適應性修復能力，誘導β細胞靜默[6]，最終導致β細胞功能衰竭和凋亡。本課題組前期的體內外研究顯示，脂代謝壓力可誘導β細胞持續的代謝炎癥損傷，致使β細胞最終應激失代償以及凋亡[7-9]。TLR4是介導上述代謝性炎癥損傷的樞紐調控因子：TLR4是脂毒性誘導β細胞損傷的必需因素之一，但TLR4通過怎樣的分子機制誘導胰島β細胞代謝應激失代償有待探討。為此，在原有研究的基礎上，本研究進一步探討PA誘導胰島β細胞功能損傷與TLR4下游信號分子JNK和Bax的關系。結果顯示，PA誘導胰島β細胞功能損傷的同時，誘導TLR4及下游信號分子JNK和Bax高表達，提示PA誘導胰島β細胞功能損傷與TLR4/JNK/Bax蛋白表達有關。既往研究也支持該研究結果：活化的JNK在細胞質內通過調控Bax和Bcl-2分子介導線粒體途徑引起的凋亡[10]。Bax和Bcl-2作為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的代表，相互之間產生拮抗作用，從而實現對細胞凋亡的調控[11]。Bcl-2和Bax兩蛋白間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，Bax升高促進細胞凋亡，Bcl-2升高則抑制細胞凋亡[11]。當凋亡發生時，Bax由細胞質轉移到線粒體并與線粒體膜結合，使得細胞色素酶C穿過線粒體膜，激活caspase-9，繼而活化caspase-3，導致細胞凋亡[12-13]。目前，國內外大多數學者把細胞Bcl-2/Bax作為判斷細胞凋亡被抑制或加強的主要標志之一[14]。研究證實，鏈脲佐菌素或高糖干預下的INS-1細胞，通過激活JNK信號通路誘導胰島β細胞[15-16]。本研究發現，PA可增加β細胞p-JNK和Bax表達，下調Bcl-2蛋白表達，使Bcl-2/Bax降低，抑制TLR4或JNK活性均可拮抗PA的作用，提示TLR4的介導作用可能活化JNK/Bax信號通路。TLR4/JNK/Bax通路可能在PA誘導脂毒性效應中發揮重要作用。

本研究進一步探討降糖藥物Exendin-4對TLR4/JNK/Bax通路的作用。Exendin-4作為GLP-1的類似物，具有改善胰島β細胞功能和非胰島素依賴途徑降血糖、維持糖化血紅蛋白穩定等特點[17]。本課題組既往研究發現，Exendin-4可抑制脂毒性誘導的胰島β細胞的氧化應激[2]，這一保護機制與抑制TLR4信號通路有關，由此推測TLR4是Exendin-4拮抗脂毒性效應的一個調控靶點，具體機制有待探討。本研究發現，Exendin-4下調PA所致的p-JNK水平的升高，推測Exendin-4可通過干預JNK信號途徑起保護胰島β細胞的作用。同時，Exendin-4干預后Bax蛋白表達下調、Bcl-2蛋白表達上調，說明Exendin-4通過調控Bax和Bcl-2蛋白的比例拮抗PA的脂毒性效應。研究還發現，激活TLR4或JNK的活性可削弱Exendin-4改善脂毒性β細胞胰島分泌功能的作用，反之抑制兩者的活性均可增加Exendin-4的良性干預作用，可見Exendin-4的干預作用與抑制TLR4/JNK/Bax信號通路有關。目前鮮有報道Exendin-4通過TLR4介導胰島β細胞脂毒性保護作用機制涉及其下游信號通路JNK/Bax，本研究對Exendin-4發揮脂毒性保護作用提供了新的補充。

綜上所述，本研究發現PA引起胰島β細胞功能障礙可能與TLR4/JNK/Bax通路有關；而Exendin-4則可抑制PA誘導的胰島β細胞GSIS障礙，下調TLR4、p-JNK和Bax的表達，并上調Bcl-2的表達。Exendin-4抑制脂毒性誘導的TLR4/JNK/Bax通路活化可能是其保護胰島β細胞功能的機制之一。本研究也存在局限性：(1)缺乏相關靶基因的敲除或過表達，以便進一步驗證因果關系；(2)尚需進行動物實驗進一步證實體外的研究結果。