慢性乙型肝炎肝組織中Atg7、LC3水平對HBV復制水平的影響

楊 林 河南省濮陽市油田總醫院醫學檢驗科 457000

乙型肝炎是一種因嗜肝DNA病毒所引起的病變，經研究統計，每年約有100萬人死于HBV感染所致的原發性肝癌和肝硬化，目前感染機制尚未明確，但抑制HBV病毒復制是解決感染慢性化的重要課題[1]。自噬可作為一種防御機制，防止外來物質入侵，可降解細胞內受損細胞器和多余蛋白質，維持細胞正常生命活動，常規情況下，細胞均存在一個自噬基礎水平，一旦機體處于蛋白質蓄積、內質網應激、病毒感染、饑餓等狀態，自噬便會利用自身成分獲得能量，進行自我保護[2]。自噬基因Atg7、LC3是自噬過程中的泛素連接酶，不僅與造血干細胞維持、脂肪分化、線粒體自噬、軸突膜運輸等有關，還在代謝應激中調節細胞周期和凋亡中具有一定作用性[3]。而本文進一步探索了慢性乙型肝炎肝組織中Atg7、LC3水平對HBV復制水平的影響，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年3月—2020年5月140例慢性乙型肝炎患者(觀察組)、140例健康體檢者(對照組)為試驗對象。觀察組男81例，女59例，年齡30～65歲，平均年齡(48.45±11.12)歲。對照組男82例，女58例，年齡31～66歲，平均年齡(48.29±11.36)歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：(1)各項資料齊全，且自愿加入本次實驗；(2)觀察組有乙型肝炎病史，且HBsAg陽性。排除標準：(1)合并腎臟疾病者；(2)存在代謝性肝病、酒精性肝病者；(3)存在自身免疫性肝病或藥物性肝損傷者；(4)合并其他病毒感染者。

1.2 篩查方法 篩查方式：細胞培養：細胞系Huh7、LC3，條件5% CO2和37℃，完全培養基為10%胎牛血清的DMEM。Atg7、LC3表達與模型建立：取細胞鋪6孔板，其中敲減組合Atg7、LC3過表達組分別采用對照質粒及pcDNA3.1-HIS-c-Atg7、LC3質粒，RNA應用3000轉染細胞，48h后分別進行EBSS北楊集處理，分析HBV病毒載量。免疫熒光：對石蠟切片進行脫蠟、抗原修復，甲醛(4%)固定15min，3次PBS洗滌，在室溫打孔10min，3次PBS洗滌，運用3%BSA和1%羊血清的封閉液室溫封閉1h，一抗4℃過夜，洗滌后，二抗避光1h，含有DAPI封片。HBV病毒載量測定：收集上清液，混勻樣本稀釋劑5μl,室溫狀態下靜置10min，加入病毒核酸定量測試盒40μl PCR混合液，離心30s，2 000r/min，用儀器(ABI VII7)完成PCR擴增，具體方法按照說明書進行。

1.3 觀察指標 (1)對比兩組自噬相關蛋白7(Atg7)、LC3、HBV-DNA水平；(2)經Pearson法分析慢性乙型肝炎發生與Atg7、LC3、HBV-DNA相關性以及HBV-DNA與Atg7、LC3相關性；(3)據AUC及標準誤評判各類篩查方式(Atg7、LC3及聯合)的預測價值。

2 結果

2.1 對比兩組各項指標 觀察組Atg7、LC3、HBV-DNA水平高于對照組(P<0.05)。如表1所示。

表1 兩組各項指標對比

2.2 分析各項指標之間相關性 慢性乙型肝炎發生與Atg7、LC3、HBV-DNA呈負相關性(P<0.05)；HBV-DNA與Atg7、LC3呈正相關性(P<0.05)。如表2所示。

表2 各項指標之間相關性分析

2.3 預測價值分析 預測價值分析顯示，Atg7篩查預測的AUC為0.814，LC3篩查預測的AUC為0.845，Atg7聯合LC3篩查預測的AUC為0.914。依據AUC及標準誤，采用Z檢驗AUC差異。如LC3與Atg7的AUC比較：Z=(0.845-0.814)/(0.035×0.035+0.041×0.041)0.5=0.575，P值=[1-NORMSDIST(0.575)]×2=0.564。聯合與LC3的AUC比較：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.035×0.035)0.5=1.909，P值=[1-NORMSDIST(1.909)]×2=0.056。聯合與Atg7的AUC比較：Z=(0.914-0.845)/(0.009×0.009+0.041×0.041)0.5=1.644，P值=[1-NORMSDIST(1.644)]×2=0.100。如表3所示。

表3 Atg7、LC3及聯合篩查預測HBV復制水平高表達價值

3 討論

自噬在病原體感染時，可影響炎性因子對外來病原微生物應答敏感性和下調干擾素對病毒感染，抑制促炎因子分泌和形成，但隨著相關研究增多，學者發現甲型流感病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質炎病毒能夠通過此過程進行復制[4]。HBV便是引起干細胞自噬主要原因，HBV可通過乙肝病毒小表面蛋白，促使自噬體形成，利用溶酶體途徑自噬調節自身分泌，而自噬可參與HBV復制過程，此為一項惡性循環，為了更好控制HBV復制，還需探索自噬基因對HBV復制過程的預判和影響[5]。

Atg7屬于一種關鍵酶，在自噬體形成期間參與了Atg8-PE和Atg12-Atg5-Atg16L1兩個關鍵自噬復合體形成[6]。在2018年一項實驗中，學者發現Atg復合體能夠干擾HBV病毒形成，減少病毒產量。在本次結果中，觀察組Atg7高于對照組，說明，乙型肝炎患者可因肝組織受損和肝功能減弱，導致自噬水平被激活，出現明顯自噬Atg7基因改變，而HBV-DNA與Atg7呈正相關性，說明HBV高表達與Atg7存在一定相關。LC3屬于自噬相關的蛋白，是一種能夠反映自噬起始階段的分子標志物，常分為兩個亞型，即LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ型，當機體發生自噬時，LC3-Ⅰ可出現脂質化變化，并形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能夠與自噬體膜上磷脂酰乙醇胺結合，定位在體膜上，含量與自噬體數量相等。本次結果中，觀察組LC3高于對照組，說明乙型肝炎患者在出現自噬體降解減少時，可影響溶酶體和自噬體融合，導致自噬體數量明顯增加[7]。經Pearson法分析，HBV高表達與Atg7呈負相關性，說明HBV高表達與多種自噬基因均存在相關性。經ROC曲線分析，LC3篩查預測的AUC為0.845，Atg7篩查預測的AUC為0.814，Atg7聯合LC3篩查預測的AUC為0.914，說明聯合Atg7、LC3篩查更能夠反映HBV復制狀態。

綜上所述，機體在合并HBV感染后，可引起Atg7、LC3表達增加，早期篩查Atg7、LC3水平，可預測HBV復制高表達情況，盡早預判疾病發生、發展，便于臨床診療。