GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠microRNA-155及Toll樣受體4表達(dá)的影響*

郭麗婷 葛煥琦 鄭 輝 王 帆 劉天文

泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院,天津市 300457

心肌梗死、卒中等動(dòng)脈粥樣硬化事件是2型糖尿病患者最主要的死亡原因。近年來(lái)，研究顯示炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。其中，microRNA-155(miR-155)作為典型的多功能miRNAs分子之一，在炎癥、免疫的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動(dòng)劑利拉魯肽作為降糖藥已廣泛應(yīng)用于臨床。最新研究顯示，利拉魯肽在改善血糖外亦有多種獲益，引起學(xué)術(shù)界的重點(diǎn)關(guān)注。研究顯示，利拉魯肽可以改善糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠的胰島素抵抗并減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷[1]。另一研究顯示，利拉魯肽可以減輕糖尿病小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[2]。目前，利拉魯肽在改善動(dòng)脈粥樣硬化及抑制炎癥中的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型為研究對(duì)象，觀察利拉魯肽對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠miR-155水平及TLR4/NF-κB表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 利拉魯肽(諾和諾德中國(guó)制藥有限公司)，SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，高脂飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，STZ(美國(guó)Sigma公司)，qPCR引物購(gòu)自北京擎科公司，血糖儀和試紙(德國(guó)拜耳)，El-800全自動(dòng)生化分析儀(PE公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡雄性SD大鼠40只，體重200～220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(NC,n=10)給予普通飲食和高脂飲食組(HFD,n=30)給予高脂飲食。高脂飼料配比：55.7%的普通飼料，12%豬油，20%蔗糖，10%蛋黃粉，2%膽固醇，0.3%膽酸鹽。6周后，HFD組一次性腹腔注射STZ(30mg/kg)，給藥后第3天和第7天分別測(cè)內(nèi)眥血血糖，均>16.7mmol/L認(rèn)為2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型成功。模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(DM)、利拉魯肽中劑量組[M-Lir, 200μg/(kg·d)，皮下注射]和利拉魯肽大劑量組[H-Lir, 400μg/(kg·d)，皮下注射][2-3]，每組10只，對(duì)照組和糖尿病組給予等量檸檬酸緩沖液，干預(yù)8周。

1.2.2 取血和主動(dòng)脈組織：用3%戊巴比妥鈉麻醉，采集心臟血液用于測(cè)定TC、TG、LDL-C和 FBG。取主動(dòng)脈根部病變組織，切成2mm長(zhǎng)的血管環(huán)備用。

1.2.3 qRT-PCT檢測(cè)：(1)組織總RNA的提取：取-80℃冰箱中保存的新鮮冰凍組織，重量約為100mg，Trizol法提取總 RNA(按說(shuō)明書(shū)操作)，用微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計(jì)算RNA的純度和濃度。(2)檢測(cè)目的基因表達(dá)水平：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(其中miR-155采用莖環(huán)法)，RNA 5μg,Oligo(dT)2μl,dNTP 4μl,5×buffer 4μl,逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,RNase inhibitor 0.5μl,加DEPC水補(bǔ)至20μl,(其中miR-155引物為L(zhǎng)oop primer),25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min，4℃ 10min，產(chǎn)物 cDNA保存于-20℃。(3)熒光定量PCR反應(yīng)體系(cDNA 稀釋5倍),SYBR Green Master Mix 10μl,上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，cDNA 4μl，ROX 0.4μl，DEPC水4.8μl,50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，×40個(gè)循環(huán)。(4)QPCR產(chǎn)物的相對(duì)定量分析 ：采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠生化指標(biāo)的影響 糖尿病組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C水平均高于對(duì)照組(P<0.01)；體重明顯下降(P<0.01)；利拉魯肽中、大劑量干預(yù)組，F(xiàn)BG、TC、TG、LDL-C水平均低于糖尿病組(P<0.05)，體重未再繼續(xù)下降，而略有增加，與利拉魯肽干預(yù)后血糖下降及“三多一少”癥狀改善有關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 利拉魯肽干預(yù)8周對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠生化指標(biāo)的影響

2.2 利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變部位炎癥基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化部位miR-155、TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與糖尿病組相比，利拉魯肽中、大劑量組miR-155和TLR4、NF-κB mRNA水平顯著下降(P<0.05)，且利拉魯肽大劑量組三者降低更顯著，尤其是對(duì)TLR4和NF-κB mRNA減低更明顯(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化組織miR-155、TLR4和NF-κBmRNA表達(dá)的影響

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是血管系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病, 由血管壁多種細(xì)胞與多種炎癥因子相互作用的結(jié)果。越來(lái)越多的研究顯示，TLR4/NF-κB炎癥通路在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中高度活躍，密切參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[4]。近年研究顯示，miR-155作為新型炎性調(diào)節(jié)因子，與TLR4/NF-κB通路的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。首先，TLR4激活后通過(guò)髓樣分化因子88(MyD88)/TRIF信號(hào)通路促進(jìn)NF-κB活化，NF-κB與miR-155HG啟動(dòng)子結(jié)合，增加成熟miR-155表達(dá)，反過(guò)來(lái)miR-155又通過(guò)負(fù)反饋抑制MyD88、IKKs的表達(dá)，增強(qiáng)NF-κB活性，激發(fā)炎性瀑布反應(yīng)，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成[5]。Kovacs等研究顯示，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞miR-155、miR-146表達(dá)增加，促進(jìn)NF-κB活性，介導(dǎo)促炎因子釋放，從而導(dǎo)致血管炎癥發(fā)生[6]。另一研究也顯示，miR-155促進(jìn)NF-κB通路大量激活，影響腫瘤壞死因子-α、白介素-6等炎癥因子釋放，增加巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成[7]。本研究顯示：糖尿病大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化病變組織miR-155水平升高，TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)也呈一致性增加。提示高血糖誘導(dǎo)miR-155表達(dá)，促進(jìn)TLR4/NF-κB炎癥通路激活，調(diào)節(jié)炎性因子和趨化因子分泌，進(jìn)而介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能障礙，參與動(dòng)脈粥樣硬化形成。因此，下調(diào)miR-155水平可能與動(dòng)脈粥樣硬化改善和心血管事件低發(fā)生率相關(guān)。Kishore等研究顯示，骨髓干細(xì)胞移植通過(guò)旁分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可以下調(diào)miR-155表達(dá)，從而改善心臟纖維化和心功能[8]。國(guó)內(nèi)也有研究顯示，下調(diào)miRNA-155表達(dá)水平可顯著減少糖尿病腦缺血大鼠腦梗死體積[9]。

近年來(lái)，新型降糖藥物利拉魯肽除降血糖外，在改善血管內(nèi)皮功能障礙、抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用受到廣泛關(guān)注，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。國(guó)外有研究顯示，利拉魯肽通過(guò)抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、TNF-α和IL-1β的分泌，發(fā)揮抗炎作用，減輕主動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[10]。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)使用不同濃度利拉魯肽干預(yù)oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞結(jié)果顯示，利拉魯肽處理的泡沫細(xì)胞TG和TC含量顯著降低，泡沫細(xì)胞胞漿脂質(zhì)滴明顯減少，此外，利拉魯肽治療后泡沫細(xì)胞表現(xiàn)出氧化應(yīng)激受損[11]。一項(xiàng)臨床研究顯示，對(duì)2型糖尿病合并肥胖的患者在二甲雙胍(1～2g/d)和磺脲類藥物(格列美脲)治療基礎(chǔ)上給予利拉魯肽1.2mg/d，6周后檢測(cè)到單個(gè)核細(xì)胞中TNF-α、IκB和TLR4 mRNA表達(dá)較對(duì)照組下降，沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(SIRT1)基因表達(dá)增加，抑制NF-κB促炎效應(yīng)，從而改善代謝狀況[12]。本研究顯示，利拉魯肽中劑量干預(yù)組miR-155水平下調(diào)，TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)均減低，在利拉魯肽大劑量組對(duì)三者的降低更為顯著，提示利拉魯肽可呈劑量依賴性改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠，下調(diào)miR-155表達(dá)，抑制TLR4/NF-κB炎癥通路，進(jìn)而減低下游炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮血管保護(hù)作用，成為糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化疾病新的治療靶點(diǎn)。另有研究也顯示，利拉魯肽可呈劑量依賴性抑制胰島素抵抗大鼠腎臟NF-κB、TNF-α和IL-6的表達(dá),利拉魯肽大劑量組[200μg/(kg·d)]比低劑量組[100μg /(κg·d)]降低更明顯，可能參與腎功能改善[13]。

綜上所述，給予糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠補(bǔ)充利拉魯肽，不僅降低了血糖、血脂，還降低了動(dòng)脈粥樣硬化組織miR-155水平及TLR4/NF-κB炎癥通路的表達(dá)，呈現(xiàn)劑量依賴性的抗炎作用，從而發(fā)揮血管保護(hù)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。