不同種源短枝木麻黃對青枯病的生理生化響應及早期選擇*

魏永成 張 勇 孟景祥 仲崇祿

(中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520)

近年來，天然林資源逐漸減少，人工林面積不斷增加，各種逆境條件下森林面積逐步擴大(Kullanetal.,2016)。然而在林木改良過程中，人們忽視了育種策略的有效推進，從而使森林病害頻發(fā)，林木受損嚴重，甚至造成毀滅性災害(Sakirogluetal.,2012)。利用抗性資源培育抗病新品種替代受害植株，能夠加速育種進程、改善森林生態(tài)效應、推動林業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展(康向陽，2020)。為有效發(fā)掘抗性資源并提高林木抗性育種效率，認識和研究林木抗性的變異模式、變異特征等基礎規(guī)律十分必要。

林木抗性強弱與其生理生化性狀關系密切，而生理生化性狀與植物生長發(fā)育之間存在一定相關性，因此利用生理生化性狀對林木進行早期選擇具有可行性。近年來，從生理生化角度探索林木早期預測己引起學者重視，如不同種源樟樹(Cinnamiomumcamphora)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)活力和葉綠素含量差異顯著，其抗脅迫能力也呈顯著差異(馬一丹，2019)；不同品種櫟樹(Quercus)苗期抗寒性差異顯著，基于SOD、POD等生理生化性狀可進行早期選擇(楊振亞，2016)；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)活力與木質素及其次生代謝產物的合成密切相關，活力越高，物質的合成代謝越強，植株的抗性能力越強。

酚類化合物包括總酚、類黃酮、花青素和酚酸衍生物，是一類重要的抗氧化劑，主要通過苯丙烷途徑在葉綠體或細胞質中合成(Boudet，2007；Khoddamietal.，2013)。酚類化合物在植物體內可發(fā)揮重要作用，如防御昆蟲侵襲，防止真菌、細菌或病毒病原體感染(Daglia，2012)，保護DNA免受氧化損傷(Agatietal.，2010)等。研究發(fā)現(xiàn)，受到生物侵襲后，類黃酮化合物迅速大量合成并能夠直接產生免疫反應(Kingetal.，1999)。同時，酚類化合物還可通過直接中和活性氧(reactive oxygen species,ROS)限制葉綠體中的ROS以降低氧化程度(Rice-Evansetal.,1997)。鑒于酚類化合物在植物體中的重要功能，研究不同種源植物體內酚類化合物的差異很有必要，將為抗性種質材料的篩選提供必要的理論支持。

木麻黃(Casuarinasspp.)抗風、耐瘠薄，是我國華南地區(qū)營建沿海防護林的先鋒樹種，在一些立地條件較差的沿海前緣沙質地帶，甚至是唯一可造林的樹種(Zhongetal.,2010)，在抵御臺風侵襲、保護農田和城市中具有不可替代的作用，同時也具有較大的經(jīng)濟價值(Zhongetal.,2013；Zhangetal.,2016)。青枯病(Ralstoniasolanacearum)是一種毀滅性植物土傳病害，傳播速度快、發(fā)病死亡率高，可危害54科200余種植物，包括許多具有重要經(jīng)濟和社會價值的植物(喬俊卿等，2013)，如煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculentum)和桉樹(Eucalyptusspp.)等，是世界范圍內最難防治的細菌性重大病害之一(Salanoubatetal.,2002；Sheetal.,2017)。木麻黃青枯病自發(fā)現(xiàn)以來，研究重點多集中在致病和抗病機制(Selvakesavanetal.,2016)等方面，在遺傳改良的基礎問題如抗性遺傳規(guī)律揭示、雜交育種等方面未見系統(tǒng)性報道。鑒于此，本研究以短枝木麻黃(Casuarinaequisetifolia)20個種源為試驗材料，對小枝中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等酶活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量8個生理生化性狀進行檢測與分析，研究不同種源短枝木麻黃對青枯病的生理生化響應，篩選和挖掘木麻黃抗青枯病優(yōu)良種源，以期為木麻黃抗病育種材料的選育和推廣提供科學依據(jù)。

1 試驗地概況與研究方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣東省徐聞縣湛江國營防護林場，地理位置 20°28′20″N，110°31′41″E。屬熱帶海洋性季風氣候，全年陽光充足，年平均氣溫23.3 ℃，年平均降水量1 364 mm，全年無霜凍。土壤為濱海沙土，肥力較低。試驗地前茬為木麻黃無性系林，青枯病暴發(fā)后砍伐清理。

種源試驗林營建于2014年4月，涉及21個種源，采用行列設計，每行1個種源，15株小區(qū)，6次重復(區(qū)組)。國際種源種子由澳大利亞種子中心提供，國內種源種子由中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所提供。本研究選擇試驗林中20個種源開展試驗，具體信息見表1。

表1 參試短枝木麻黃種源信息Tab.1 Origins of C． equisetifolia provenances and families

1.2 取樣方法

2019年8月于試驗林內取樣，鑒于試驗林每個重復中種源保存率差異較大，取樣時單個小區(qū)各種源隨機選擇10株單株，6個小區(qū)選擇其中4個作為重復，每株選擇長約40 cm的1年生小枝水培接種青枯菌；對選擇的10株單株，每株選擇直徑3 mm左右的當年生褐梗小枝(當年生小枝分為嫩枝、綠梗小枝和褐梗小枝，其中嫩枝和綠梗小枝尚未木質化，不能反映材料的抗病或感病特性；褐梗小枝為木質化程度較高的枝條，能反映出明顯的抗病或感病特征)截取2 cm，液氮保存，4次重復。

1.3 性狀測定與數(shù)據(jù)處理

水培小枝接種青枯菌(許秀玉，2017)，待處理間出現(xiàn)明顯差異時(約接種1個月)，調查接種青枯菌后木麻黃枝條萎蔫情況，計算植株的相對病害強度(relative disease intensity,RDI)，對枝條不同萎蔫程度進行病情指數(shù)分析(郭權等，1986)。相對病害強度越低，植株受損越少，抗性強度越高，而病情指數(shù)越低，抗性強度越高。參考郭權等(1986)的木麻黃抗病性標準，以幼苗萎蔫數(shù)量替代死亡數(shù)量，將侵染后的木麻黃劃分為6個等級：0級，完全無萎蔫現(xiàn)象；1級，參試種源中<20%幼苗(株數(shù))出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；2級，20%～40%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；3級，40%～60%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；4級，>60%幼苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；5級，完全萎蔫或死亡。相對病害強度和病情指數(shù)計算公式如下：

相對病害強度(RDI)=萎蔫分枝數(shù)/分枝總數(shù)；

(1)

病情指數(shù)=∑(各級萎蔫株數(shù)×該萎蔫級值)/

(調查總株數(shù)×最高級值)×100。

(2)

式中：最高級值為病情指數(shù)分級標準中的最大值，即5級。

參考陳建勛等(2002)方法提取并測定各樣品生理性狀，包括超氧化物歧化酶(SOD,U·g-1)、過氧化氫酶(CAT，U·g-1)、過氧化物酶(POD,U·g-1)、苯丙氨酸解氨酶(PAL,U·g-1)等酶活力以及可溶性糖(mg·g-1)、葉綠素(mg·g-1)含量；參考王翠穎等(2012；2015)方法提取并測定總酚[mg·(100 g)-1FW]和類黃酮[mg·(100 g)-1FW]含量。各性狀重復測定3次，取平均值。

性狀間相關系數(shù)計算公式為：

(3)

利用SPSS和EXCEL軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan多重比較法對各種源進行多重比較。方差分析模型為：

Yij=Bi+Pj+Eij。

(4)

式中：Bi為區(qū)組效應；Pj為種源效應；Eij為誤差項效應。

基于測定的SOD、CAT、PAL等8個生理生化性狀均值對參試的木麻黃種源進行綜合評價，指數(shù)選擇函數(shù)公式為：

(5)

式中：I為選擇指數(shù)值；wi為i性狀的評價權重；ui為i性狀的表型值。

通過主成分分析法計算生理生化性狀在綜合評價中所占權重(汪小欽等,2020)。

2 結果與分析

2.1 接種青枯菌后種源病情特征分析

接種青枯菌后，各種源表現(xiàn)出不同的病情特征。有些種源(如18269、18119等)萎蔫枝條多，甚至植株完全死亡；有些種源(如18142、18403等)小枝生長正常，顏色無顯著變化，僅少數(shù)小枝出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。20個種源(圖1)病情特征結果表明，小枝接種青枯菌后病情指數(shù)和相對病害強度在種源間存在極顯著差異(P<0.01)，其中病情指數(shù)在種源間變幅為2.13～74.89，相對病害強度在種源間變幅為10.64%～93.62%。

圖1 各種源病情特征差異Fig.1 Variation of disease characteristics in provenances

2.2 種源間生理生化性狀變異分析

對各生理生化性狀進行方差分析(表2)發(fā)現(xiàn)，PAL活力在種源間呈顯著差異，SOD、CAT、POD活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚和類黃酮含量在種源間均呈極顯著差異。這表明參試種源性狀變異幅度大，具有較強選擇潛力。

木麻黃各種源SOD、CAT、POD、PAL活力以及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量的總平均值(表2)分別為335.19 U·g-1、16.84 U·g-1、49.05 U·g-1、179.93 U·g-1、19.67 mg·g-1、1.60 mg·g-1、945.45 mg ·(100 g)-1和111.33 mg ·(100 g)-1，變異系數(shù)分別為17.75% 、27.72%、64.31%、38.65%、25.31%、16.63%、44.00%和29.50%，性狀均值最大種源分別為最小種源的1.61、2.74、13.75、2.46、2.43、1.98、2.93和2.59倍。這進一步說明種源間的變異幅度大，有必要進行種源間選擇。

表2 種源間生理生化性狀的多重比較分析①Tab.2 Multiple comparative analysis of physiological and biochemical traits among provenances

2.3 生理生化性狀間及與病情特征相關分析

木麻黃20個種源生理性狀間相關性分析(表3)表明，SOD活力與CAT活力、總酚含量、類黃酮含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.233～0.330，與POD活力、葉綠素含量呈極顯著負相關。CAT活力與PAL活力、可溶性糖含量、總酚含量和類黃酮含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)為0.319～0.466,與POD活力和葉綠素含量呈極顯著負相關。總酚含量與類黃酮含量呈極顯著正相關，相關系數(shù)達0.722。可見，SOD、CAT、PAL活力以及可溶性糖、總酚和類黃酮含量增加對POD活力和葉綠素含量會產生一定抑制作用。

表3 8個生理生化性狀間相關性分析①Tab.3 Correlation analysis among eight physiological and biochemical traits

木麻黃20個種源生理生化性狀與病情特征相關性分析(表4)表明，生理生化性狀與病情特征間均達到顯著或極顯著正相關或負相關程度。SOD和CAT活力等6個生理生化性狀與病情特征間呈顯著或極顯著負相關關系，相關系數(shù)為-0.823～-0.418，其中類黃酮含量與相對病害強度間的負相關程度最高，相關系數(shù)為-0.823，POD活力和葉綠素含量與病情特征間呈極顯著或顯著正相關。這表明生理生化性狀和病情特征可能受相同或類似的調控機制控制，SOD活力和類黃酮含量等生理生化性狀表現(xiàn)越強，植物病害程度越低。

表4 生理生化性狀與病情特征間相關性分析①Tab.4 Correlation analysis among physiological and biochemical traits and disease index

2.4 優(yōu)良種源選擇

將數(shù)據(jù)按極差法標準化后進行綜合評價，SOD、CAT、POD、PAL活力及可溶性糖、葉綠素、總酚、類黃酮含量8個生理生化性狀的權重分別為0.095 5、0.125 2、0.087 5、0.140 7、0.136 5、0.090 3、0.147 6和0.176 6，根據(jù)選擇指數(shù)排序，按照30%的入選率篩選出18144、18142、18135、18355、18128和18122共6個優(yōu)良種源，其SOD、CAT、PAL活力以及可溶性糖、總酚和類黃酮含量均值比總體均值分別高1.35%、25.32%、13.19%、19.69%、32.52%和32.24%；相對地，入選種源的POD活力和葉綠素含量均值比總體均值分別低42.91%和26.37%(表5)。

表5 優(yōu)良種源篩選及各性狀表現(xiàn)Tab.5 Selection of superior provenances and families and their traits

3 討論

3.1 優(yōu)良種源的篩選

為篩選出適宜病害區(qū)推廣的種質材料，應從盡可能大的區(qū)域范圍內收集種源，并結合抗病特性與生理生化性狀比較不同種源間的差異。本研究基于不同國家和地區(qū)的20個種源，通過分析不同種源短枝木麻黃對青枯病的生理生化響應開展優(yōu)良種源篩選，充分挖掘了短枝木麻黃的優(yōu)良種源及其育種潛力。

短枝木麻黃接種青枯菌后各種源病情特征存在顯著差異，生理生化性狀變異幅度較大，具有較強選擇潛力。基于生理生化性狀進行綜合評價，按照30%的入選率篩選出6個優(yōu)良種源，優(yōu)良種源的生理生化性狀表現(xiàn)與小枝接種青枯菌后的病情特征基本相符，病情指數(shù)和相對病害強度較低，萎蔫枝條少，生長基本正常，這表明根據(jù)生理生化性狀篩選的優(yōu)良種源抗病性較強，可作為進一步遺傳改良的材料。

3.2 防御酶系統(tǒng)的變異

植物受到環(huán)境脅迫時，體內一系列防御酶會發(fā)生廣泛的生理響應，產生系統(tǒng)抗性，其中關注較多的主要有SOD、CAT、POD和PAL等幾大類酶，如樟樹通過提高CAT含量抵御脅迫，桉樹通過SOD和POD增強抗性響應脅迫，木荷(Schimasuperba)則在防御酶調節(jié)下體現(xiàn)其抗性(張海娜等，2019)。可溶性糖和葉綠素含量也是植物防御系統(tǒng)的重要評價性狀，種培芳等(2015)研究紅砂(Reaumuricasoongorica)對干旱脅迫的生理響應，結果發(fā)現(xiàn)葉片和根系中可溶性糖等物質含量變幅較大，與植物抗逆性密切相關，能夠在一定程度上反映出植物的抗性強弱；此外，葉綠素含量也是品種選育過程中的重要參考性狀(馬劍英等，2007)。本研究短枝木麻黃接種青枯菌后，SOD、CAT、POD活力以及可溶性糖和葉綠素含量在種源間差異達到極顯著水平，反映出短枝木麻黃不同種源間存在極為豐富的遺傳變異基礎，可為抗性種源選擇提供充足的材料保障。

掌握生理生化性狀間的相關關系，能夠大大縮短育種時間，降低遺傳改良成本，對于優(yōu)良種源選育工作具有重要指導意義。本研究不同種源短枝木麻黃生理生化性狀相關分析發(fā)現(xiàn)，POD活力與SOD、CAT、PAL活力呈極顯著負相關，可能是因為植物防御酶系統(tǒng)發(fā)生生理響應時SOD、CAT、PAL大量合成，活力較高，為避免抗氧化酶物質積累過多對植株本身造成不良影響，POD含量降低，以維持防御酶系統(tǒng)的相對穩(wěn)定性，與郭祖國等(2018)研究結果相一致；同時，SOD、CAT和PAL活力與相對病害強度和病情指數(shù)呈極顯著負相關，POD活力與相對病害強度和病情指數(shù)呈極顯著正相關，推測防御酶的調控機制與病害進程協(xié)同進行，選擇其中一種性狀會導致其他性狀同增或同減，這在遺傳改良過程中可充分利用。

3.3 次生代謝物質在種質材料間的差異

總酚和類黃酮是植物次生代謝物質的重要組成部分，是植物正常生長發(fā)育過程中必不可少的物質。研究發(fā)現(xiàn)，核桃(Juglansregia)感染黑斑病(Xanthomonasjuglandis)后其總酚類物質含量顯著升高，且早期變化與抗病性強弱呈顯著正相關，抗病性越強的無性系其積累量越高，可作為檢測抗病性的候選參考指標(蔣時姣，2019)。不同地理種源紅松(Pinuskoraiensis)的總酚和黃酮含量差異顯著，受到病蟲危害后紅松次生代謝物質呈上升趨勢(左彤彤等，2019)。韓晉等(2019)根據(jù)銀杏(Ginkgobiloba)葉片和花粉中總黃酮含量篩選出3個優(yōu)良單株，說明總黃酮在銀杏單株間也存在顯著或極顯著差異，具有極大選擇潛力。當林木含水量高時，生理代謝旺盛，抗性強，如抗黑斑病(Marssoninabetulae)樺樹(Betulaspp.)葉片含水量顯著高于感病樺樹，且高抗植株中的苯丙氨酸解氨酶活性強、酚類物質含量多(Green etetal.,2007)，與本研究結果一致。本研究不同種源短枝木麻黃總酚和類黃酮含量在種源間均達到極顯著差異，選擇次生代謝物質含量高的種質材料，可在一定程度上提高林木抗性，對林木抗性育種開展具有重要參考價值。

已有研究表明，許多植物體內總酚和類黃酮物質含量與抗病性相關，但這些次生代謝物質參與抗病防御的具體作用機制尚未完全明確(Hassaneinetal.，2016)。因此，利用現(xiàn)代生物學技術，包括多組學分析，揭示木麻黃響應青枯菌的分子機制是木麻黃抗病育種的重要方向，尋找可能參與植物防御反應的相關基因和代謝途徑，如感病后不同種質材料內類黃酮合成通路中關鍵酶或基因的變化規(guī)律，將有助于獲得抗病材料。

4 結論

接種青枯菌后，不同種源短枝木麻黃病情指數(shù)和相對病害強度差異顯著，保護酶系統(tǒng)和次生代謝物等性狀在種源間均呈顯著或極顯著差異，具有較強選擇潛力。根據(jù)生理生化性狀篩選出的6個抗病種源，可作為進一步遺傳改良的材料。