繡球染色體制片技術優化及rDNA物理定位*

郭瑞紅 邱 帥 劉光欣 高 凱 魏建芬 席夢利

(1.南京林業大學 林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室 南京 210037； 2.杭州市園林綠化股份有限公司 杭州 310020)

繡球(Hydrangeamacrophylla)隸屬于虎耳草科(Saxifragaceae)繡球屬(Hydrangea)。繡球屬植物原產于日本和我國長江流域，共約73種，我國是世界繡球屬植物的分布中心，擁有47個種和11個變種(海風等，2014；喬謙等，2020)。該屬植物具有碩大飽滿的聚傘花序、豐富多變的花色、適應性強、易扦插繁殖等特征，現已廣泛用于鮮切花生產、園林造景和盆花栽培(吳可鵬等，2019)。目前，國內市場的主導商品栽培種多引自歐洲、美國及日本等國，我國雖然有豐富的繡球屬種質資源，但這些資源尚未被充分開發利用，市場上仍缺乏具有自主產權的優良品種(喬謙等，2020)。繡球屬新品種選育的主要方法仍然是傳統的雜交育種，但其雜交技術復雜，種子微小，種子的收獲及播種比較困難(曾奕等，2018)，加之對繡球屬植物的分類、系統進化和遠緣雜交技術等基礎研究工作開展較少，現有成果難以對育種實踐起到輔助作用，導致我國的繡球屬育種嚴重落后于歐美等發達國家。繡球屬植物分子細胞遺傳學研究可以揭示其染色體組成及特征，探究其系統進化關系，為繡球屬雜交育種的親本選配提供依據，從而指導繡球屬植物的雜交育種。

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是20世紀80年代發展起來的一項分子細胞遺傳學技術，該技術利用特異的DNA序列為探針，通過原位雜交方式將其雜交到特定染色體上，從而達到標定并識別不同染色體的目的。染色體特異序列探針FISH技術為染色體圖譜的構建提供了高效方法(辛昊陽等，2016；Xinetal.，2020)，已廣泛應用于多種植物的分子細胞遺傳學研究(Jiangetal.,2006；Lanetal.,2018)，但繡球屬物種的細胞學研究報道較少。已有研究結果顯示，繡球屬物種染色體較小，中期染色體平均長度1～2 μm，基因組2C值1.95～5.00 pg(Cerbahetal.,2001)，部分物種中存在B染色體(Mortreauetal.,2010)，二倍體及多倍體均有報道(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。而基于FISH技術的研究僅查閱到1篇以45S rDNA為探針及1篇以45S rDNA和5S rDNA為探針的報道，上述研究揭示了繡球屬物種間45S rDNA和5S rDNA在染色體上的分布具有多態性(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。本研究以繡球水培根尖為材料，探討不同預處理試劑、預處理時間和酶解時間對染色體形態及制片效果的影響，比較用45S rDNA和5S rDNA質粒間接標記的長探針與直接合成的45S rDNA和5S rDNA短探針FISH的信號差異，以期為繡球屬植物分子細胞遺傳學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料來源于南京林業大學校園內種植的繡球‘無盡夏’(Hydrangeamacrophylla‘Endless Summer’)，2020年9—10月間，選取當年生半木質化枝條，置于光照培養箱內水培，培養條件為每天光照10 h、黑暗14 h，溫度26 ℃，每天換水1次。

1.2 根尖取材及預處理

選擇晴天上午9:00—10:00，收集水培繡球枝條上長0.5～1 cm的根尖。將根尖分別采用以下3種方法進行不同時間梯度預處理：1)根尖用1 MPa一氧化二氮(N2O)室溫處理0.5、1、2 h；2)根尖置于0.7 mmol·L-1環己酰胺水溶液中室溫處理1、3、5 h；3)根尖置于2 mmol·L-18-羥基喹啉水溶液中避光室溫處理2、4、6 h。根尖經過預處理后，立刻用去離子水洗凈，然后轉入新鮮配制的卡諾固定液中(V無水乙醇︰V冰乙酸=3∶1)保存，次日重新換1次卡諾固定液，-20 ℃保存備用。

1.3 染色體制片及熒光原位雜交

1.3.1 染色體制片 染色體制片參照蘭月(2018)的方法，并進行部分調整。根尖從固定液中取出后放入去離子水中，洗去卡諾固定液。切取根尖分生區組織，置于4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中，在37 ℃恒溫箱內分別酶解0.5、1、2 h。酶解后的分生組織用移液槍轉移到水中終止酶解，再從水中轉移至載玻片上。用鑷子輕輕擠壓出分生組織細胞，除去多余雜質，滴加20 μL 60%的乙酸，用解剖針混合攪勻組織。將載玻片置于溫度為55 ℃的烘片機(Leica HI 1220)上，用解剖針涂抹細胞懸液，制片干燥前用新鮮配制的卡諾固定液沖洗后氣干。相差顯微鏡下初步檢片，選擇染色體形態較好且分散的制片，-20 ℃保存備用。

1.3.2 染色體制片固定 為了改善DAPI染色效果，制片用4%多聚甲醛固定10 min，然后用2×SSC室溫洗3次，每次5 min，再用70%、90%、100%乙醇進行逐級脫水各5 min。

1.3.3 探針制備 本研究用rDNA探針分為2類：一類為美國密西根州立大學蔣繼明教授實驗室惠贈的水稻(Oryzasativa)5S rDNA質粒和45S rDNA質粒，采用缺刻平移法分別用地高辛和生物素對其進行標記，為了描述方便，這類探針本文稱為長探針；另一類為本團隊依據擬南芥(Arabidopsisthaliana)5S rDNA和45S rDNA編碼區序列合成的寡核苷酸(Oligo)探針，5S rDNA用FAM(6-carboxyfluorescein)修飾，45S rDNA用TAMRA(rhodamine)修飾，這類探針本文稱為短探針(席夢利等，2018；Lanetal.,2018)。

1.3.4 雜交液制備及變性 每張染色體制片配制20 μL雜交液，雜交液成分包括約40 ng的探針DNA、50%去離子甲酰胺、2×SSC和10%硫酸葡聚糖。包含長探針的雜交液于98 ℃變性10 min后立即放入冰中冷卻5 min以上；短探針是合成的單鏈DNA，故包含短探針的雜交液不需要變性。

1.3.5 染色體制片變性與雜交 染色體制片在85 ℃、70%去離子甲酰胺中變性2 min后，立即轉移到70%、90%、100%冰乙醇中進行逐級脫水各5 min，制片氣干。每張染色體制片滴加20 μL雜交液，用Rubber Cement封片。制片放置于濕盒中，37 ℃恒溫箱內雜交過夜。

1.3.6 制片漂洗及抗體檢測 長探針制片從濕盒中取出后，揭掉Rubber Cement，2×SSC室溫洗5 min，42 ℃熱洗20 min，1×TNT洗5 min。地高辛和生物素標記的探針分別用anti-digoxigenin rhodamine (Anti-Digoxigenin-Rhodamine Fab fragments,Roche,11207750910)和anti-biotin FITC(Fluorescein Anti-Biotin,Vector Laboratories,SP-3040)進行抗體檢測。每張制片加約100 μL抗體孵育液(取anti-digoxigenin rhodamine和anti-biotin FITC各1 μL加入到100 μL的1×TNT中混勻)，37 ℃恒溫箱內孵育1 h。然后進行第2次洗脫，1×TNT洗3次，每次5 min，1×PBS洗5 min，晾干制片。每張制片用20 μL含有DAPI的封片膠(Vector Laboratories,H-1200)封片。制片在Olympus BX51型熒光顯微鏡下觀察拍照，所有拍攝圖片用Photoshop CS6與Image J軟件進行后期處理與圖片合成。

短探針帶有熒光基團，雜交完成后可直接在熒光顯微鏡下檢測拍照。短探針雜交完成后，揭掉Rubber Cement，用2×SSC室溫洗5 min，洗掉蓋玻片，然后用1×TNT漂洗3次，每次5 min，用1×PBS洗5 min，晾干制片。每張制片用20 μL含有DAPI的封片膠封片。制片在Olympus BX51型熒光顯微鏡下觀察拍照，所有拍攝圖片用Photoshop CS6與Image J軟件進行后期處理與圖片合成。

1.4 數據統計與分析

在研究不同預處理對染色體形態的影響時，為了避免根尖生理狀態對試驗的影響，每種處理制備10張染色體制片，每張制片用2個根尖，選擇其中3張分裂相較多的制片進行數據統計，不同處理統計的分裂相數有30～64個。為了減少誤差，每張染色體制片在顯微鏡下進行3次重復觀察，分別統計出分裂相總數和染色體形態良好的分裂相數，采用Excel軟件進行計算分析，得出平均值和標準差。形態良好的中期分裂相占比(%)=形態良好的中期分裂相數/總分裂相數×100%，形態良好的中期分裂相是染色體數目足夠且染色體濃縮適當的分裂相。平均值±標準偏差(%)是3張染色體制片中形態良好的中期分裂相占比的平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 不同預處理對染色體形態的影響

采用1 MPa N2O、0.7 mmol·L-1環己酰胺和2 mmol·L-18-羥基喹啉3種方法對繡球根尖進行不同時間梯度預處理，觀察統計發現：1 MPa N2O預處理0.5 h，大部分中期分裂相染色體較長，濃縮不充分(圖1A)，形態良好的中期分裂相比例為46.67%(表1)；預處理1 h，染色體濃縮適當，大部分染色體的著絲粒位置可辨(圖1B)，形態良好的中期分裂相比例達58.8%(表1)；預處理2 h，染色體濃縮過度，呈點狀(圖1C)，形態良好的中期分裂相比例為50%(表1)。0.7 mmol·L-1環己酰胺預處理1 h和3 h，大部分中期分裂相染色體較長，濃縮不充分(圖1 D、E)，形態良好的中期分裂相比例分別為31.25%和52.39%(表1)；預處理5 h，染色體濃縮適當，但大部分染色體的著絲粒位置不可辨(圖1F)，形態良好的中期分裂相比例為26.37%(表1)。2 mmol·L-18-羥基喹啉預處理2、4、6 h，形態良好的中期分裂相比例分別為32.5%、45.24%和34.92%，3個預處理時間染色體濃縮適當，但大部分染色體的著絲粒位置不可辨(圖1G、H、I)，處理2 h的染色體可以觀察到異染色質(圖1G)。綜合考慮染色體長度、著絲粒位置及形態良好的中期分裂相比例，認為1 MPa N2O處理1 h是繡球根尖預處理的最適條件。

圖1 不同預處理對染色體形態的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods on chromosome morphology標尺 Scale bars:10 μm.A-C:N2O分別預處理0.5、1、2 h；D-F:環己酰胺分別預處理1、3、5 h；G-I:8-羥基喹啉分別預處理2、4、6 h。A-C:N2O pretreated for 0.5,1 and 2 h,respectively;D-F:Cycloheximide pretreated for 1,3 and 5 h,respectively;G-I:8-hydroxyquinoline pretreated for 2,4 and 6 h,respectively.

表1 預處理對根尖細胞染色體制片效果的影響Tab.1 Effect of pretreatment on chromosome preparation of root tip cells

2.2 不同酶解時間對染色體制片的影響

選用1 MPa N2O預處理1 h的根尖，將根尖分生組織用4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液于37 ℃分別酶解0.5、1、2 h后涂片，制片用卡寶品紅染色后，在Olympus BX41顯微鏡下觀察拍照。觀察發現：酶解0.5 h獲得的制片，中期分裂相和細胞核周圍都可觀察到明顯的細胞質(圖2A、B)，這些細胞質的存在使染色體不能充分外露，在后續的FISH試驗中容易產生背景信號，從而影響FISH信號的捕獲；酶解1 h獲得的制片，中期分裂相背景干凈、染色體分散程度好(圖2C)；酶解2 h獲得的制片，染色體容易丟失，觀察到很多不完整分裂相(圖2D)。對比后發現，酶解1 h所獲得的染色體制片質量明顯高于酶解0.5 h和2 h，因此，繡球根尖分生組織在4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中37 ℃酶解1 h比較合適。

圖2 不同酶解時間對染色體制備效果的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on chromosome preparation標尺 Scale bars:10 μm.箭頭所指代表細胞質。The arrow points to the cytoplasm.A&B:0.5 h;C:1 h;D:2 h.

2.3 長探針和短探針rDNA對FISH結果的影響

選用1 MPa N2O處理1 h的根尖，酶解1 h后用涂片法制備的高質量中期染色體制片進行FISH對比試驗。觀察30個中期分裂相后發現：繡球染色體數目為36，染色體基數為18，是二倍體(2n=2x=36)。45S rDNA的長探針和短探針均可產生良好的雜交信號，2種探針產生的雜交信號強度差異不明顯，幾乎每個分裂相都可檢測到2個很強的雜交信號。這說明45S rDNA的長探針和短探針均可用于繡球45S rDNA在染色體上的物理定位研究。多個分裂相對比確定，45S rDNA位于1對近端著絲粒染色體的短臂末端(圖3)。5S rDNA的長探針和短探針產生的雜交信號均很弱，長探針在50%的中期分裂相上可以檢測到2個清晰的信號，而短探針僅在37%的中期分裂相上可以檢測到2個稍弱的信號，且多數分裂相上都呈現明顯的背景信號。多個分裂相對比確定，5S rDNA位于1對端著絲粒染色體的長臂末端(圖4)。

圖3 長探針FISH結果Fig.3 The FISH results of long probes標尺 Scale bars:10 μm.A:中期染色體灰度圖像；B:5S rDNA信號；C:45S rDNA信號；D:染色體與rDNA信號合成圖。A:Grayscale image of metaphase chromosomes;B:Signals of 5S rDNA;C:Signals of 45S rDNA;D:Merged picture from A,B and C.

圖4 短探針FISH結果Fig.4 The FISH results of short probes標尺 Scale bars:10 μm.A:中期染色體灰度圖像；B:5S rDNA信號；C:45S rDNA信號；D:染色體與rDNA信號合成圖。A:Grayscale image of metaphase chromosomes;B:Signals of 5S rDNA;C:Signals of 45S rDNA;D:Merged picture from A,B and C.

3 討論

獲得高質量染色體制片是開展分子細胞遺傳學研究的基礎，高質量染色體制片不僅要求染色體濃縮適當、形態良好、著絲粒位置易辨，而且要求分裂相沒有細胞質背景，染色體分散性好，以便進行后續的測量分析或FISH試驗。植物材料的預處理及制片方法對染色體制片質量影響顯著，在開展細胞學研究時需要針對不同的植物材料，探索預處理及制片方法對染色體制片質量的影響。根尖分生組織比其他分生組織細胞分裂更活躍、材料獲取更容易，因此，根尖是細胞學研究的常用材料(林秀琴等，2011；楊亞飛等，2020)，加之繡球扦插易生根，故本研究選用根尖作為試驗材料，探索不同預處理方式、預處理時間及酶解時間對染色體形態及制片效果的影響。細胞學研究中富集中期染色體的常用預處理有物理方法和化學方法。N2O預處理屬于物理方法，主要通過高壓使染色體凝縮，該處理方法已在馬鈴薯(Solanumtuberosum)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、柑橘(Citrus)等植物中成功獲得了形態良好的中期染色體(Brazetal.,2018；Martinsetal.,2019；Songetal.,2020；Heetal.,2020)。本研究采用1 MPa N2O預處理繡球根尖1 h，也獲得了形態良好的中期分裂相占比高、著絲粒位置可辨的染色體制片。環己酰胺和8-羥基喹啉預處理屬于化學方法，通過抑制或破壞紡錘絲的形成，使染色體處于中期。本文研究團隊采用環己酰胺預處理曾在百合(Lilium)、郁金香(Tulipa)、楊樹(Populus)等植物中取得了很好的效果(Liuetal.,2017；Lanetal.,2018；Xinetal.,2020)，但預處理繡球根尖后，制片中大部分染色體的著絲粒位置不可辨。盡管已有報道認為8-羥基喹啉可使染色體的縊痕和次縊痕清晰可見(劉丹等，2015；官錦燕等，2020；葉天文等，2020)，但8-羥基喹啉預處理繡球根尖后，其大部分中期染色體的縊痕不可辨，這可能是由于不同植物根尖對不同預處理方式的敏感程度不同所致。比較分析發現：1 MPa N2O預處理1 h的繡球根尖，用4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液于37 ℃酶解1 h后涂片，是獲得高質量繡球根尖染色體制片的最佳試驗流程。

rDNA(45S rDNA和5S rDNA)為探針的FISH技術，是進行植物染色體識別、植物分類及植物系統進化等領域研究的強有力工具。傳統的rDNA-FISH技術，多將模式植物擬南芥、水稻或小麥的45S rDNA和5S rDNA分別構建在質粒載體中，通過大腸桿菌(Escherichiacoli)繁殖克隆質粒DNA、質粒DNA提取、缺刻平移法標記探針等步驟獲得可用于FISH的rDNA探針。該方法獲得的rDNA探針為長度100～300 bp的雙鏈DNA(即長探針)。近年來，隨著DNA合成技術的迅猛發展，依據rDNA的序列特征，開發出了長度20～59 bp的rDNA單鏈寡核苷酸(Oligo)探針(即短探針)，與傳統的長探針構建過程相比，短探針具有純度高、合成成本低、探針長度一致、使用簡便、雜交效率高等特點(Tangetal.,2014)。為了對2種探針的雜交效果進行比較，本研究采用長、短探針分別在繡球根尖中期染色體上進行原位雜交試驗，結果發現45S rDNA長、短探針的雜交效果相似，5S rDNA長探針的檢出率高于短探針，但短探針也可以達到試驗目的。鑒于短探針具有試驗便捷、成本低廉的特點，因此，推薦選用短探針進行繡球rDNA在染色體上的物理定位研究。

繡球屬植物的染色體基數、倍性及rDNA雜交信號在染色體上的分布變化較大。多數繡球屬植物染色體基數為18，二倍體36條染色體(2n=2x=36)，栽培品種存在大量的三倍體(2n=3x=54)和四倍體(2n=4x=72)，但長葉繡球(Hydrangeainvolucrata)染色體基數為15(2n=2x=30)，馬桑繡球(H.aspera)染色體基數為17(2n=2x=34)(Mortreauetal.,2010)。45S rDNA在繡球屬植物均位于染色體的短臂末端，圓錐繡球‘Unique ’(H.paniculata‘Unique’)分布在2對染色體上，櫟葉繡球‘Sikes Dwarf’(H.quercifolia‘Sikes Dwarf’)和馬桑繡球分布在2對染色體上，而繡球‘Fasan’(H.macrophylla‘Fasan’)、長葉繡球及本研究的繡球‘無盡夏’均位于1對染色體上(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。5S rDNA在繡球屬植物均分布在1對染色體上，長葉繡球和粗枝繡球(H.robusta)位于近著絲粒的位置，紫彩繡球(H.sargentiana)及本研究的繡球‘無盡夏’位于長臂末端(Laereetal.,2010；Mortreauetal.,2010)。這就意味著rDNA在繡球屬植物中的分布具有廣泛的多態性，可以對繡球屬植物的分類提供參考。

國內外學者在繡球屬植物的系統發育方面已開展了一些研究工作，但繡球屬植物種類繁多、形態變異復雜，基于形態學和不同分子標記揭示的種間親緣關系仍有不少分歧(張梅等，2021)。rDNA在染色體上的分布特征是揭示物種間親緣關系的有效手段，其在染色體上分布的位點數量及分布位置越相似，說明其親緣關系越近(翁天均，2011)。因此，未來應在多種繡球屬植物中開展rDNA物理定位研究，通過比較分析rDNA在染色體上的分布特點、染色體基數及倍性，揭示繡球屬物種間的親緣關系，以輔助繡球屬植物的雜交育種實踐。

4 結論

繡球根尖用1 MPa N2O預處理1 h，根尖分生組織置于4%纖維素酶和2%果膠酶混合酶液中在37 ℃酶解1 h后用涂片法制片，獲得的中期分裂相染色體濃縮適當，背景干凈，染色體分散程度好，大部分染色體的著絲粒位置可辨，該方法可以獲得高質量染色體制片。45S rDNA長、短探針的FISH效果相似，5S rDNA長探針的檢出率高于短探針。但由于短探針具有試驗便捷、成本低廉的特點，因此，推薦選用短探針進行繡球rDNA在染色體上的物理定位研究。本研究建立的繡球根尖高質量中期染色體制備及rDNA物理定位技術體系可高效分析鑒定繡球屬植物的染色體數目及rDNA的分布，為繡球屬雜交育種的親本選配提供依據，從而指導繡球屬植物的雜交育種工作。