深圳梧桐山不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤微生物多樣性分析*

龔金玉 彭金根 謝利娟 張銀鳳 李朝嬋 王艷梅

(1.河南農業大學林學院 鄭州 450002；2.深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院 深圳 518055；3.貴州師范大學貴州省山地環境重點實驗室 貴陽 550001)

毛棉杜鵑(Rhododendronmoulmainense)為杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)常綠灌木或小喬木，花期每年3—4月，花朵簇生，淡紫色或淺粉色，新梢無毛且多呈淺綠色，老梢多呈褐色或深褐色，常生長在海拔700～1 500 m的山林中，喜涼爽濕潤氣候，是較為稀缺的高山杜鵑品種，具有極高的觀賞和應用價值(景慧娟等，2018；康美麗等，2009；吳志等，2009)。毛棉杜鵑屬淺根系植物，根系多為須根，種子自然萌發困難，人工育苗存在移栽成活率較低、生長較差等問題。當前，毛棉杜鵑研究主要集中在花芽分化(謝利娟等，2009；2010)、抗熱性(王凱紅等，2011)、繁殖(熊友華等，2011)、菌根共生(洪文君等，2016)和光合特性(白宇清等，2017)等方面，關于毛棉杜鵑根際微生態的探索以及根際微生物多樣性的研究尚未見報道。

根際指受植物根系影響的微型區域(Hiltner，1904)，根際微生物指在該微型區域內受植物根系影響的微生物，如細菌、真菌、放線菌等，對植物生長發育、土壤健康等具有重要作用。根際微生態系統包括土壤、植物根系和土壤微生物三大部分，是連接大氣、水體、土體、生物體碳流通的中間環節，是生態系統碳循環的關鍵部分，其穩定性對植物健康生長十分重要(李繼光等，2019)。土壤微生物按其對植物的影響不同，可分為促進植物生長的有益微生物和抑制植物生長的致病菌等(Mendesetal.,2013)，且土壤微生物也是反映土壤養分狀況的重要指標(肖燁等，2015)。康捷等(2019)對麻山藥(Dioscoreaopposita)不同生長時期根際土壤微生物多樣性及群落結構特征研究表明，根際土壤優勢微生物在植物不同生長時期變化顯著，推測與植物生長發育有關。楊瀟湘等(2019)基于高通量測序分析大豆(Glycinemax)和油菜(Brassicanapus)根際土壤微生物群落結構的差異發現，根際土壤富含有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等可促進植物生長的生防菌。尤垂淮等(2015)對云南烤煙(Nicotianatabacum)根際微生態研究得出，烤煙連作會使根際病原微生物富集，引發根際微生態平衡失調，導致烤煙長勢變弱。于文喜等(1998)研究落葉松枯梢病(Botryosphearialaricina)發病原理發現，病原菌侵染會使落葉松樹勢衰退，嚴重者甚至導致樹體死亡。桑娟萍等(2013)對小隴山林區調查發現，該林區林木病原菌種類豐富，可侵染寄主，引起葉部病害。

毛棉杜鵑是深圳梧桐山風景區的主要建群種，每年的“毛棉杜鵑花節”都會吸引大量市民上山賞花，毛棉杜鵑資源對梧桐山具有重要意義，已成為其閃亮的生態名片。梧桐山毛棉杜鵑現存在生長勢差、樹勢衰退現象，這是否與其根土壤際微生物有關？根際土壤微生物在毛棉杜鵑樹勢衰退過程中是否發生變化？鑒于此，本研究從毛棉杜鵑根際土壤入手，分析不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤理化性質和微生物多樣性，探明毛棉杜鵑樹勢退化與根際土壤理化性質和微生物群落結構間的關系，以期為保障梧桐山毛棉杜鵑種群更新和演替提供理論支撐。

1 研究區概況與研究方法

1.1 研究區概況 梧桐山風景區位于深圳市東部，屬亞熱帶濕潤氣候，年均降水量1 926.8 mm，平均氣溫22.4 ℃，全年溫和濕潤。土壤多為赤紅壤、山地黃壤等，含石英砂且呈弱酸性。區內植被豐富，保護較好，主要建群種為毛棉杜鵑、浙江潤楠(Machiluschekiangensis)、亮葉冬青(Ilexnitidissima)等，景觀以闊葉景觀為主、針闊混交景觀為輔。

1.2 土壤樣品采集 采用抖落法采集不同樹勢(優、中、劣)毛棉杜鵑根際土壤(Rileyetal.，1969)，分別記作AR、MR和DR(表1)。每種樹勢分別選取3塊標準地，每塊標準地內毛棉杜鵑樣樹不少于5株，樹齡相近且營養管理水平一致。在每塊樣地內利用五點取樣法挖取0～20 cm毛棉杜鵑細根(直徑D≤2 mm)，用無菌刷收集根際周圍2 mm范圍內的土壤作為根際土壤，每塊樣地采集的根際土壤混為一個樣品，裝于無菌采樣袋內用車載冰箱帶回實驗室，挑出其中的枯枝落葉并過2 mm篩(已提前殺菌)。將土壤樣品分為2份：一份用于測定土壤理化性質,一份用于高通量測序。

表1 不同樹勢樣地的植物生長統計①Tab.1 Statistics of plant growth in different tree potential plots

1.3 土壤理化性質測定 土壤理化性質測定參考魯如坤(2000)方法：采用酸度計法測定土壤pH；采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質含量；采用半微量凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；采用烘干法測定土壤含水量。

1.4 土壤DNA提取 土壤DNA提取采用NucleoSpin Soil kit (Macherey-Nagel)DNA土壤提取試劑盒，按說明書操作。PCR擴增用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS1區；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細菌v3+v4區。細菌PCR反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共30循環，72 ℃反應5 min后將擴增產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行純化、回收。真菌PCR反應條件為：95 ℃、5 min，95 ℃、1 min，50 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35循環，72 ℃反應7 min后將擴增產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進行純化、回收。產物送至北京百邁客生物科技有限公司進行后續樣品建庫，并利用Illumina HiSeq平臺進行高通量測序。

1.5 數據分析 高通量測序后得到的原始數據采用FLASHv1.2.11、Trimmomatic、UCHIME等工具進行拼接、過濾、去除嵌合體，基于97%的相似性對數據進行聚類，以測序得到所有序列數的0.005%為閾值過濾劃分OTU，再基于Silva(細菌16S)、Unite(真菌ITS)分類學數據庫對OTU進行分類學統計。使用QIIME2軟件評估樣品的α多樣性，對樣本序列隨機取樣，構建稀釋性曲線并統計多樣性指數等，比較不同樹勢樣本的真菌和細菌豐度和多樣性；使用QIIME軟件分析樣品的β多樣性；線性判別分析流程(LEfSe)在http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy網址中獲取。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析 根際土壤理化性質分析結果(表2)表明，3種樹勢之間土壤理化性質雖然有所不同，但無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同樹勢土壤理化性質分析Tab.2 Analysis of soil physicochemical properties of different potential trees

2.2 不同樹勢土壤樣品微生物測序序列處理及優化分析 分析所有土壤樣品測序數據，其中真菌原始數據共718 760條，經質控、拼接后得到高質量數據712 423條，過濾后得到有效序列710 302條；細菌原始數據共719 088條，高質量數據714 155條，有效序列681 807條(表3)。所有樣本的稀釋性曲線走向趨于平緩，樣本OTU特征數不會再隨測序條數增加急劇增加，表明測序深度已足夠反映樣品的物種多樣性(圖1)。

圖1 根際土壤細菌(a)、真菌(b)稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curve of the rhizosphere soil bacteria(a)and fungi(b)

表3 根際土壤樣品真菌和細菌測序結果統計Tab.3 Sequencing results of fungi and bacteria in the rhizosphere soil samples

2.3 α多樣性分析 α多樣性反映單個樣品的物種豐度和物種多樣性，主要包括Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Coverage等指數。由表4可知，不同樹勢之間根際土壤真菌豐度MR最大，且與AR、DR差異顯著；細菌Ace、Chao1等指數呈DR>MR>AR的規律，且DR與AR的差異達到顯著水平(P<0.05)。所有樣本的Coverage指數均為1.00，說明樣本測序深度已達檢測要求，測序結果能夠代表樣本中微生物真實情況。

表4 根際土壤真菌和細菌α多樣性分析Tab.4 α diversity analysis of fungi and bacteria in the rhizosphere soil

2.4 微生物分類學水平分析 采用樸素貝葉斯分類器結合比對方法對特征序列進行分類學注釋，結果見表5。所有樣本共注釋真菌10門489種，細菌27門438種，不同樹勢樣本的真菌和細菌多樣性均極其豐富。

表5 根際微生物物種分類學統計Tab.5 Taxonomic statistics of rhizosphere microorganisms

圖2所示為根際細菌和真菌在門水平上的群落結構特征(物種豐度前十且占比大于0.1%的門)。由圖2a可知，細菌豐度前十的物種分別為酸桿菌門(Acideobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微桿菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、WPS-2、厚壁菌門(Firmicutes),其中酸桿菌門、變形菌門、放線菌門三者豐度之和占比75%以上。由圖2b可知，真菌豐度前十的物種分別為擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、梳霉門(Kickxellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、毛霉門(Mucoromycota)，其中擔子菌門、子囊菌門、被孢霉門三者的豐度之和占比90%以上。

從圖3可看出，3種樹勢樣本中共有細菌OTU序列1 661個，占OTU總數的82.7%，共有真菌OTU序列387個，占OTU總數的34.3%，這說明根際細菌群落多樣性在3種樹勢之間具有高度相似性，而根際真菌OTU差異較大。

在目水平上(表6)，細菌豐度前十的物種分別為Solibacterales、酸桿菌目(Acidobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、Subgroup_2、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、Betaproteobacteriales、Gammaproteobacteria_Incertae_Sedis、Elsterales、黏球菌目(Myxococcales)、SBR1031，其中Solibacterales、酸桿菌目、根瘤菌目、Subgroup_2和Gammaproteobacteria_Incertae_Sedis的豐度隨樹勢衰退不斷降低，而黏球菌目、SBR1031的豐度隨樹勢衰退逐漸增大；真菌豐度前十的物種分別為蠟殼耳目(Sebacinales)、散囊菌目(Eurotiales)、蘑菇目(Agaricales)、肉座菌目(Hypocreales)、被孢霉菌目(Mortierellales)、糞殼菌目(Sordariales)、盤菌目(Pezizales)、柔膜菌目(Helotiales)、糙孢孔目(Trechisporales)、古根菌目(Archaeorhizomycetales)，3種樹勢之間的優勢真菌目差異不大，但優勢樹與劣勢樹之間差異較大，尤其是盤菌目與柔膜菌目，其中柔膜菌目可侵染杜鵑根系形成菌根。

表6 土壤樣本細菌和真菌在目水平上各菌群相對豐度百分比①Tab.6 Percentage of relative abundance of bacteria and fungi(order)in soil samples at order level

2.5 β多樣性分析 由圖4可知，細菌β多樣性MR與DR、AR相交，說明MR與DR、AR存在相似性，而AR與DR之間微生物群落差異大；同理，MR在真菌β多樣性上與DR具有相似性，DR與AR之間真菌群落差異大。由圖5可知，細菌β多樣性AR、DR組間差異較小，土壤樣品聚為一類，但MR組內差異較大，可能是因為中庸樹的根際微生物已發生改變，但其樹勢尚未有明顯變化；在真菌β多樣性上AR與MR之間差異較小，與DR存在組間差異。由此可知，不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤微生物多樣性存在一定差異，且AR與DR在細菌和真菌上差異程度不同，AR與DR的真菌差異更大。與主坐標分析結果相同，樹勢相差越大，微生物差異也越大，其中真菌差異更大。

圖4 土壤樣品細菌(a)、真菌(b)主坐標分析Fig.4 Principle coordinate analysis of soil sample bacteria(a)and fungi (b)

圖5 細菌(a)、真菌(b)群落結構UPGMA聚類樹Tig.5 UPGMA cluster tree of bacteria(a)and fungi(b)community structure

2.6 真菌組間差異顯著性分析 LEfSe進化分支圖可發現具有統計學差異的Biomarker，當選擇LDA score大于3.5時，代表Biomarker顯著差異。如圖6所示，紅色和綠色分別代表AR和DR，柱形寬度代表其LDA score，即不同組間物種差異影響程度，可以發現，主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)、Arthrobotrys屬、Pseudaleuria、Pyronemataceae科等。目前，Archaeorhizormyces屬的功能尚不可知，但已有研究表明其具有根系生長特異性(周攀，2015)。Phookamsak等(2014)研究發現，Phaeosphaeriaceae科是Pleosporales目中的一大科，同時也是經濟作物上重要的植物病原體。馮歡(2017)研究發現，Leucoagaricus(白環蘑屬)對青楊(Populuscathayana)抗性具有一定促進作用。

圖6 根際真菌LEfSe分析的進化分支圖和LDA得分(LDA>3.5)Fig.6 Least discriminant analysis(LDA)effect size taxonomic and LDA score of the discriminants comparing rhizosphere fungi

3 討論

根際環境對植物生長具有重要作用，植物生長過程中也會不斷調節根際環境，改變根際微生態(王新洲等，2010；國輝等，2011；李繼光等，2019)。在根際微生物中，既包括通過養分競爭、拮抗作用和誘導系統抗性等機制抑制土壤病原菌，進而促進植物生長的根際“益生菌”，也包括抑制植物生長甚至導致植株死亡的根際“有害菌”，其中根際“益生菌”對植物生長發育和生理代謝至關重要(周文杰等，2016)。周文杰等(2015)研究根際優勢細菌甜櫻桃(Cerasusspp.)幼樹光合及根系活力的影響，結果表明幼樹接種根際優勢促生細菌提高了植株凈光合速率、水分利用率和根系活力。全妙華等(2018)探究最適宜栽培忽地笑(Lycorisaurea)的土壤時發現,一些未分類的優勢真菌與忽地笑鱗莖內石蒜堿含量呈極顯著正相關。由于根際微生物的特殊功能，對其的研究越來越多，如彭政等(2020)研究指出，藥用植物和根際微生物的多樣性和豐度具有密不可分的關系。除此之外，植物土傳病病害發生與根際微生物也有著密切關系，多年生植物在長期生長過程中會通過分泌作用調節植物根系微生態的平衡(Zhangetal.,2013)，微生態的破壞會產生負面效應，導致植物根系發育不良、植株矮小、生長緩慢、抗性下降甚至植株死亡，嚴重的還會引起連作障礙(韋菊玲等，2019)。影響植物根際微生物多樣性和群落結構的原因很多，不同種植年限(納小凡等，2016)、生育時期(常穎萃等，2013)、海拔(徐佳欣等，2018)等的植物根際微生物均存在差異。劉宇等(2018)對海南鳳仙花(Impatienshainanensis)可培養根際微生物研究發現，根際微生物多樣性以及優勢微生物種類隨海拔、季節變化均有差異。劉艷霞等(2016)對煙草根系分泌物研究得出，根系分泌物中的苯丙酸可促進病原菌生長、抑制拮抗菌生長。

利用高通量測序技術分析梧桐山不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤微生物群落結構及多樣性，注釋到根際真菌10門489種，其中優勢真菌門為擔子菌門(49.3%～59.3%)、子囊菌門(32.0%～40.8%)和被孢菌門(1.7%～4.6%)等，與廖映輝等(2016)對海南霸王嶺毛棉杜鵑根際真菌檢測出的優勢真菌相同；根際優勢細菌門主要為酸桿菌門(36.3%～47.2%)、變形菌門(31.2%～32.0%)和綠彎菌門(3.0%～7.7%)，與方敏等(2019)對馬纓杜鵑(Rhododendrondelavayi)根際微生物檢測的優勢細菌相同。從根際微生物α、β多樣性分析可看出，不同樹勢根際土壤微生物之間細菌差異性較小，但真菌差異性較大，尤其是AR與DR之間差異最大，其中主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)等，而子囊菌綱柔膜菌目已在澳州杜鵑 (Rhododendronlochiae)中證明為優勢種群，且為菌根真菌類群(Bougoureetal.,2005)。3種樹勢毛棉杜鵑根際微生物群落結構存在差異，但目前僅為原位試驗，尚未進行控制試驗，差異微生物的功能和作用有待后續進一步研究。

在自然界中，杜鵑花科植物易受真菌侵染形成杜鵑花類菌根(Read，1996)，菌根形成會擴大根系與土壤的接觸面積，增加吸收土壤水分養分的能力。對此，有學者認為外生菌根形成利于杜鵑屬植物對不利環境的適應性，增加植物的脅迫抗性。歐靜等(2013)研究桃葉杜鵑(Rhododendronannae)外生菌根時發現，外生菌根形成不僅可促進其地上與地下生物量積累，而且還會促進某些激素分泌。因此，對毛棉杜鵑根際土壤的研究，利于探究毛棉杜鵑根際微生物群落結構，探明影響其微生態平衡的關鍵因素，能夠為保障梧桐山毛棉杜鵑種群更新和演替提供一定理論支撐。

4 結論

不同樹勢毛棉杜鵑根際土壤理化性質無顯著差異，土壤理化性質不是樹勢衰退的主要影響因素，而不同樹勢之間根際土壤微生物群落結構差異顯著，且樹勢差異越大其真菌群落結構差異越大，主要差異真菌為Archaeorhizormyces屬、Phaeosphaeriaceae科、Helotiales(柔膜菌目)等。