氫氣對AGEs誘導人視網膜微血管內皮細胞凋亡及AKT/eNOS/NO通路的影響

馮梅 張娟 佘春燕 張青松

人視網膜微血管病變是多種代謝性疾病和心血管疾病的并發癥，如糖尿病、高血壓、白血病等都可引起視網膜微血管發生病變。以機體內大分子物質為原料，通過非酶促反應生成的穩定共價鍵產物-糖基化終末產物(advanced glycation end products, AGEs)是損傷視網膜微血管的重要因素之一。AGEs能夠刺激內皮細胞氧化應激反應，使細胞發生凋亡，進而導致內皮屏障功能發生障礙[1，2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是重要的舒血管因子，當視網膜微血管內皮細胞受到一系列損傷時，其NO釋放量會減少，血管平衡穩態被打破[3]。蛋白激酶/內皮型一氧化氮合酶(protein kinase/endothelial nitric oxide synthase, AKT/eNOS)通路的活化可以促進NO的釋放，從而降低血管內皮細胞的損傷和凋亡[4，5]研究報道，氫氣(hydrogen,H2)在機體中具有一定的生理作用，可作為抗氧化劑降低機體氧化應激反應[6]。多個研究表明，大鼠腦缺血動物模型吸入氫氣后通過抗氧化作用可以減輕再灌注損傷和炎性病變[7，8]。目前關于氫氣對AGEs誘導人視網膜微血管內皮細胞凋亡及AKT/eNOS通路的影響并不十分清晰，我們圍繞此課題展開研究，揭示了氫氣在抗視網膜微血管內皮細胞凋亡中的部分機制。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

實驗研究。人視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells,hRMECs)購自上海澤葉生物科技有限公司；AGE-BSA購自美國Biovision公司；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培養基、鏈霉素和青霉素均購自美國Gibco公司；細胞培養板購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；0.2%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；噻唑藍(MTT)、蛋白濃度測定試劑盒和蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；NO檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；AKT抗體、eNOS抗體、p-AKT抗體和p-eNOS抗體均購自TaKaRa公司。

超凈工作臺購自江蘇蘇凈集團安泰公司；CO2恒溫細胞培養箱購自德國Heraeus公司；高速低溫離心機購自SIGMA公司；Facscalibur流式細胞儀購自美國BD公司；電泳儀、凝膠成像儀、分光光度儀均購自Bio-Rad公司。

二、方法

1.HRM制備及實驗分組：將H2在0.4 MPa高氣壓下溶解于細胞培養基中，現配現用并過濾消毒，富氫培養基的有效濃度為0.06 mmol[9]。

將hRMECs隨機分為4組，每組各設置5個平行對照：(1)正常組：正常培養hRMECs 24 h，不加干預；(2)AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA[10]，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h；(3)HRM組：用HRM培養基培養hRMECs 24 h，不另加干預；(4)HRM+AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA和HRM培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。

2.MTT法檢測hRMECs活力：將hRMECs以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl，培養24 h使細胞融合度達到90%左右時進行后續實驗。按照hRMECs的分組進行干預和培養后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，37 ℃孵育4 h，棄去培養基，每孔加入150 μl DMSO，避光并用振蕩器混勻，酶標儀測定每孔細胞的570 nm吸光度(A)值。細胞活性(%)=(A1～4組-A空白組)/(A1組-A空白組)×100%，空白組為150 μl的細胞培養基，用以排除培養板和培養基本底吸光值對實驗的影響。

3.流式細胞術檢測hRMECs凋亡：配制密度為1×106個/ml的hRMECs單細胞懸液，2 ml/孔接種于6孔板中，細胞培養箱中培養24 h。按照hRMECs的分組對細胞進行干預和培養后，棄去上層培養基并加入胰蛋白酶對細胞進行消化，加入新的培養基終止消化后，4 ℃、1500 r/min離心10 min收集細胞，無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細胞2次，隨后用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液將細胞重懸，再次調整細胞密度為1×106個/ml。取各組100 μl重懸后的細胞分別加入流式管中，做好分組標記，再向流式管中加入5 μl Annexin V-FITC抗體和5μl Annexin V-PI抗體，快速混合均勻后避光孵育15 min，加入400 μl緩沖液混勻后上樣流式細胞儀，分析細胞凋亡情況，全程冰上操作。

4.比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性：將hRMECs以1×106個/ml的密度接種于細胞培養瓶中，按照hRMECs的分組進行處理和培養。加入胰蛋白酶對細胞進行消化，1500 r/min離心10 min，棄去培養基，用無菌PBS洗滌1次，收集細胞并加入細胞裂解液作用15 min，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進行Caspase-3和Caspase-9活性測定，通過酶標儀測定405 nm吸光度(A)值。

5.檢測hRMECs的NO含量：將hRMECs以1×106個/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml，培養箱中培養24 h使其形成單細胞層。按照hRMECs的分組對細胞進行干預和培養，棄去舊培養基并加入胰蛋白酶消化細胞，終止消化后離心，無菌PBS洗滌細胞2次，離心收集細胞再加入細胞裂解液，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進行檢測，酶標儀測定各組540 nm吸光度，根據標準曲線計算出各組NO的含量。

6.蛋白質印跡法(Western-Blot, WB)檢測hRMECs的AKT、eNOS、p-AKT及p-eNOS蛋白水平：hRMECs接種同比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性測定，再按照hRMECs的分組對細胞進行干預和培養。棄去培養基，用胰蛋白酶消化細胞，培養基終止消化，1500 r/min離心10 min收集細胞，用無菌PBS洗滌細胞2次，1500 r/min、10 min再次離心并棄上清，加入細胞裂解液，低溫10000 r/min離心10 min，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白。蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，小心取出凝膠并使用電轉儀進行PVDF轉膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1h，加入稀釋(1:1000)后的對應一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1:2000)后的二抗溶液，室溫搖床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統拍照。

三、統計學分析方法

利用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，方差齊性采用one way ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊采用one way ANOVA中Welch修正值，組間兩兩比較采用tamhane's T2值，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、H2對AGEs誘導hRMECs活力的影響

從結果中可以看出，相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組的細胞活力顯著降低(P<0.05)；相較于AGEs組，HRM+AGEs組的細胞活力顯著升高(P<0.05)，各組細胞活性數據見表1。

表1 H2對AGEs誘導hRMECs活力的影響

二、H2對AGEs誘導hRMECs凋亡的影響

結果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細胞凋亡率相比于正常組和HRM組顯著升高(P<0.05)；HRM+AGEs組的細胞凋亡率相比于AGEs組顯著降低(P<0.05)，結果見表2、圖1。

表2 H2對AGEs誘導hRMECs凋亡的影響

圖1 各組hRMECs細胞凋亡情況

三、H2對AGEs誘導hRMECs凋亡相關蛋白水平的影響

由結果可知，與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯升高(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯降低(P<0.05)，實驗結果見表3。

表3 H2對AGEs誘導hRMECs的Caspase-3和Caspase-9活性的影響

四、H2對AGEs誘導hRMECs的NO含量的影響

結果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細胞NO含量相比于正常組和HRM組明顯降低(P<0.05)；HRM+AGEs組的細胞NO含量相比于AGEs組明顯升高(P<0.05)，結果見表4。

表4 H2對AGEs誘導hRMECs的NO含量的影響

五、H2對AGEs誘導hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

從結果中可以看出，與正常組相比，HRM組、AGEs組和HRM+AGEs組的細胞AKT和eNOS蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；但各組磷酸化信號蛋白p-eNOS和p-AKT水平明顯改變：與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組細胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著升高(P<0.05)，見表5、圖2。

圖2 H2對AGEs誘導hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

表5 各組hRMECs中p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平

討 論

視網膜病變可由多種代謝性疾病引發，以糖尿病為例：患者體內的胰島素代謝異常致使血液成分發生改變，高血糖的環境會使AGEs不斷產生并積累，引起視網膜微血管內皮細胞的損傷和功能異常，隨著病情的發展，表現為糖尿病性視網膜病變[11，12]。視網膜微血管發生病變會導致視力下降、眼底出血，甚至視網膜脫離造成失明[13]。因此，探究AGEs誘導視網膜微血管內皮細胞損傷的機制對于防治血管病變具有重要的臨床意義。

目前，研究者們對氫氣在多種疾病治療中發揮的抗氧化能力、抗炎癥能力和抗凋亡能力等方面進行了研究。Zhang等[14]發現，哮喘小鼠模型吸入氫氣后，可通過抑制炎癥介質和抗氧化失衡來減輕氣道炎癥和改善肺功能。除了氫氣吸入治療，富含氫的溶液也具有抗氧化應激保護細胞的作用[15]。王衛娜等[16]研究顯示，富含氫的培養基能顯著抵抗脂多糖導致的內皮細胞損傷。本研究構建人視網膜微血管內皮細胞AGEs損傷模型并設置富氫培養基干預組，結果顯示相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組細胞活力降低，凋亡率升高，凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9活性升高；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細胞活力升高，細胞凋亡率下降，凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9活性降低。表明H2在人視網膜微血管內皮細胞中對AGEs導致的凋亡具有抑制作用。

多個研究發現，不同藥物在對AGEs誘導血管內皮細胞凋亡的抑制過程中涉及到AKT/eNOS信號通路的激活，細胞內活化的AKT與eNOS結合定位于細胞膜，并使eNOS磷酸化，活化的eNOS催化產生NO，用于保護細胞[17-19]。NO是維持血管正常張力所不可缺少的，它可與血管平滑肌細胞內的相應受體結合，引起血管平滑肌松弛，使血管擴張[20]。在糖尿病患者體內，血糖持續升高會使eNOS活性降低，NO的產生也隨之減少，使得血管舒張功能紊亂，造成血液局部流速降低，導致內皮細胞凋亡。為探究H2在AGEs導致的人視網膜微血管內皮細胞的凋亡中發揮抑制作用是否與AKT/eNOS信號通路相關，本研究檢測了各實驗組細胞的NO含量以及AKT、eNOS、p-AKT和p-eNOS蛋白表達水平，結果顯示AGEs組和HRM+AGEs組與正常組和HRM組相比，細胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著降低，NO含量降低；HRM+AGEs組與AGEs組相比，細胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著升高，NO含量升高。該結果表明，H2可激活AKT/eNOS信號通路，通過促進AKT和eNOS磷酸化，上調NO的釋放量，從而抑制人視網膜微血管內皮細胞的凋亡。

綜上所述，氫氣對AGEs誘導的人視網膜微血管內皮細胞的凋亡具有抑制作用，該作用可能通過激活AKT/eNOS/NO通路得以發揮。本研究初步探討了氫氣對AGEs誘導人視網膜微血管內皮細胞損傷的作用及機制，為防治血管病變相關研究提供一定方向和實驗基礎，但其中涉及的具體機制以及應用氫氣的臨床安全性還有待于更深一步的研究和更多的臨床實驗來驗證。