活體中的真菌孢子和培養真菌孢子的共焦顯微鏡對照研究

張醇 程燦 應方微 呂潔璇 林寶濤 于莉 嚴宗輝 聶丹瑤 黎明

真菌廣泛分布于我們生活的環境，在正常情況下人體有皮膚等屏障可以阻止真菌的侵入，但在眼部外傷，特別是植物外傷后，真菌感染角膜引起真菌性角膜潰瘍，甚至是真菌眼內炎[1-3]。該病的臨床癥狀重，用藥時間長，同時復發率也較高，在部分缺乏檢查手段的地區確診有一定困難。臨床上，對該病的早期診斷和早期治療對患者的視力預后至關重要，有助于減少臨床誤診、角膜穿孔、眼內炎等嚴重預后，對挽救患者的視力作用非常顯著[2-5]。近年來，我國眼科臨床應用活體角膜共焦顯微鏡，能早期、快速地在真菌性角膜潰瘍中發現真菌菌絲，從而早期確診該病，并通過該設備儀器的檢查結果指導臨床用藥治療[1-5]。

臨床上通過角膜共焦顯微鏡確診的真菌性角膜潰瘍，大部分都是絲狀菌所致，國內少有關于孢子致病的報道，這是因為致病孢子較小，直徑不到1 μm，在共焦顯微鏡下容易與眼部的雜質或者是那他霉素滴眼液的藥物粉塵相混淆，臨床確診困難[1-5]。我們采用激光角膜共焦顯微鏡，對11例角膜潰瘍刮片、培養確診為近平滑假絲酵母菌患者的角膜潰瘍灶和培養菌落涂片進行檢測，研究其共焦顯微鏡圖像的特點，為早期診斷該病打下基礎，報道如下。

資料與方法

一、一般資料

(一)入選標準：1.患者有以下病史之一：(1)明確的外傷史，特別是植物傷史;(2)角膜接觸鏡佩戴;(3)長期激素應用病史;(4)化療或者免疫抑制劑應用病史；2.角膜潰瘍有以下特點之一：(1)潰瘍邊界毛糙、不光滑，邊緣可呈毛刷狀，周邊可有偽足、衛星灶或免疫環;(2)角膜潰瘍灶有干硬感或云霧狀;(3)可伴有前房積膿、內皮斑或者后彈力層皺褶等較重的炎癥反應；3.潰瘍灶處刮片取材、真菌培養陽性，致病菌鑒定為近平滑假絲酵母菌[1-5]。

(二)入選對象：從2008年11月至2018年11月在本院潰瘍刮片、真菌培養鑒定為近平滑假絲酵母菌性角膜潰瘍患者共11例(11只眼)，其中男性8例，女性3例；左眼4例，右眼7例。患者年齡(31±4.7)歲(24～49歲)。起病時間(19±4.6)d(14～26 d)。

二、真菌取材培養方法：采用0．5%愛爾凱因滴眼液點患眼3次表面麻醉，固定患瞼，采用自制胡須刀片在角膜潰瘍灶處刮取新鮮的病變組織，在無菌操作臺中分別接種于沙氏培養基(SDA)和馬鈴薯培養基(PDA)，然后在25 ℃培養箱中培養7～14 d，每日觀察，菌種鑒定時將培養物轉種察氏基做小培養，觀察菌落形態和鏡下特征。

三、近平滑假絲酵母菌角膜潰瘍灶的角膜激光共焦顯微鏡的活體檢查方法：(1)表面麻醉：采用0.5%愛爾凱因滴眼液麻醉患眼3次；(2)鏡頭準備：用丙酮棉簽清潔共焦顯微鏡頭的前表面后，點上一大滴VidisicTM凝膠作為耦合劑，點凝膠時應避免氣泡逸入其中；(3)共焦顯微鏡鏡頭帽安裝：將共焦顯微鏡Rostock角膜接觸帽從無菌包裝中取出，安裝于物鏡頭上，使鏡頭帽通過耦合劑與物鏡連接；(4)患者體位、頭位及眼位：患者坐于檢查臺前，頭部的前額和下頜分別緊靠頭托和下顎托，眼位注視前方的固視光點；(5)CCD攝像頭的位置：應調節CCD懸臂使CCD攝像頭的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直；(6)將共焦顯微鏡激光物鏡頭前移至患者角膜前5～10 mm處，通過位移微調，使Rostock角膜接觸帽與角膜中心接觸；(7)再微調共焦顯微鏡物鏡頭及焦距，當顯示器上出現角膜圖像時踩下記錄所需圖像，最后通過顯示器篩選需要的圖象并存盤；(8)潰瘍灶的選點：選擇潰瘍灶的中央、周圍浸潤灶與透明角膜交界區的上、下、鼻和顳側共5 點為特定檢查位點；(9)檢查注意事項：檢查時，物鏡頭需繞潰瘍灶檢查1周，以免遺留死角；。(10)檢查后對獲取圖像進行評估，應注意潰瘍灶中真菌孢子的有無、孢子密度的高低及形態。

四、對培養近平滑假絲酵母菌菌落的激光共焦顯微鏡檢查方法：(1)鏡頭準備：用丙酮棉簽清潔共焦顯微鏡頭的前表面后；(2)將培養基上的菌落轉接涂抹于Rostock角膜接觸帽的外表面，點上一大滴VidisicTM凝膠作為耦合劑，再將其裝在物鏡頭上；(3)打開電源開關，通過微調調整，掃描角膜接觸帽外表面的菌落圖象，同時踩下記錄按鈕，記錄所需圖像。

結 果

一、角膜激光共焦顯微鏡觀察活體近平滑假絲酵母菌角膜潰瘍灶的特點

為了便于描述，我們根據潰瘍灶處孢子的多少，孢子有無聚集成團現象以及聚集的程度，分類進行介紹。

第一類、潰瘍灶處有孢子出現，孢子數量可多可少，但孢子尚無聚集成團的現象(圖1～4)。

第二類、潰瘍灶處大量孢子聚集，形成不同形狀的高反光團塊狀結構，但這些聚集的孢子密度還不夠大，激光尚能穿過成像(圖5～8)

第三類、團塊狀聚集的孢子進一步聚集疊加，孢子團密度增高，影響激光穿過成像，孢子團中央為暗區，成像不清(圖9～圖11)。

二、近平滑假絲酵母菌培養菌落涂抹在激光共焦顯微鏡下的特點

培養鑒定后的近平滑假絲酵母菌養菌落，涂抹于角膜接觸帽的外表面，再將其裝在物鏡頭上，采用激光角膜共焦顯微鏡觀察菌落特點。在角膜激光顯微鏡下，該菌落由細小、高反光、顆粒狀的的孢子構成，聚集呈團塊狀(圖12，13)。

圖1 白色箭頭處顯示潰瘍灶內有少量孢子出現，在共焦顯微鏡下孢子非常細小，直徑在1 μm以下，為中-高反光的細小顆粒狀結構。上圖右側是角膜上皮細胞，黑色箭頭處顯示潰瘍的邊界 圖2 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍灶處有大量孢子出現(大量、細小、中-高反光的顆粒狀結構)，但尚未聚集成團。上圖的下方是角膜上皮細胞，黑色箭頭處顯示潰瘍灶的邊界 圖3 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍灶中大量孢子出現(大量、細小、中-高反光的顆粒狀結構)，但尚未聚集成團。上圖的上方可見角膜基質細胞 圖4 顯示角膜激光共焦顯微鏡下，潰瘍灶中的大量孢子，黑色箭頭處的條索狀結構為角膜顯微縫線，該顯微縫線周圍有較多的孢子出現。白色箭頭處顯示脫落的角膜上皮細胞 圖5 白色箭頭處顯示大量真菌孢子聚集成不同形狀的高反光、近圓形、團塊狀結構，其內可見大量細小的、高反光顆粒狀孢子結構。上圖的下方是角膜基質結構 圖6 白色箭頭處顯示大量真菌孢子聚集成形狀不規則的、高反光、團塊狀結構，其內可見大量細小的、高反光顆粒狀孢子結構。上圖的左下方是角膜基質結構 圖7 顯示大量真菌孢子聚集成更大的、形狀不規則的、高反光、團塊狀結構，該團塊狀結構是由大量細小的、高反光顆粒狀孢子結構聚集構成 圖8 顯示團塊狀結構進一步融合為更大片的團塊狀結構，其內有大量細小的、高反光顆粒狀孢子結構聚集 圖9 白色箭頭處顯示團塊狀結構進一步融合為更大片的團塊狀結構，大量孢子在團塊狀結構中央聚集疊加，影響激光穿過成像，為暗反光結構，其內成像不清。在這里團塊狀結構的周邊部，孢子密度較小，激光仍能通過成像，可見周邊有大量聚集的、細小、高反光顆粒狀孢子聚集 圖10 顯示大量孢子聚集成弧形、條狀的團塊狀結構，中央有孢子大量聚集、疊加形成的暗區，周邊可見大量顆粒狀的孢子聚集。白色箭頭處顯示較多孢子聚集、折疊形成類似孢子團的邊界結構 圖11 顯示孢子大量聚集、疊加形成的暗區，其右上方孢子密度較低，可見大量顆粒狀的孢子聚集。上圖的左側及下方可見角膜基質結構 圖12 共焦顯微鏡下可見大量、細小、顆粒狀的孢子聚集成團塊狀，形態不規則。在上圖的背景中可見將孢子涂抹于角膜接觸帽時產生的刮痕，呈暗反光、細條狀結構 圖13 大量、細小、顆粒狀的孢子聚集成團塊狀，形態不規則。背景中可見將孢子涂抹于角膜接觸帽時產生的刮痕，呈暗反光、細條狀結構 圖14 顯示較多、細小的孢子懸浮于潰瘍周圍角膜條狀的小凹里 圖15 顯示較多脫落的孢子懸浮于潰瘍灶的積液里，上圖的左邊可見積液的液氣交界面。

三、近平滑假絲酵母菌的孢子從生長處脫落下來，可以懸浮于潰瘍灶的積液或者附近角膜小凹的積液里(圖14，15)。

四、根據上述圖片分析，真菌性角膜潰瘍灶中的孢子和培養出的真菌菌落涂片的孢子在角膜激光共焦顯微鏡上的圖像基本一致。

討 論

假絲酵母菌是我國真菌性角膜潰瘍致病菌中的一類，其廣泛存在于人體皮膚、口腔、陰道等處，是典型的條件致病菌。人體致病的假絲酵母菌屬有4～5種，致病力最強的是白色念珠菌(白假絲酵母菌)，該酵母菌的孢子及菌絲均可致病；第二為熱帶假絲酵母菌，第三為近平滑假絲酵母菌位，第四為偽熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌等[6]。在假絲酵母菌屬中，臨床上眼科最常見是白色念珠菌，臨床報道最多。近平滑假絲酵母菌相對較為少見，國內臨床上有零星報道[7-9]，國外報道較多[10-24]，其在人體眼部常規情況下僅產生孢子，是孢子致病的酵母菌。同時在臨床檢驗室常規真菌培養條件下，土豆葡萄糖培養基和沙氏培養基38 ℃或28 ℃ 培養3～21 d，其菌落中也只出現孢子，不出現菌絲。真菌孢子刮片情況下，不容易與眼部的組織碎屑鑒別，早期刮片容易漏診。通過共焦顯微鏡研究真菌孢子在活體下的特點[1-14]，有助于我們早期發現診斷該類孢子致病的真菌性角膜潰瘍。

我們搜集了10年間在本院確診的11例近平滑假絲酵母菌所致的真菌性角膜潰瘍，其孢子在角膜潰瘍灶中有如下特點：(1)在潰瘍灶中的孢子在共焦顯微鏡下是中-高反光的細小顆粒狀結構，孢子非常細小，直徑在1 μm以下，非常容易與潰瘍灶中的雜質或者藥物粉塵顆粒混淆；孢子未聚集成團時，在潰瘍灶中的分布可多可少，參見圖1～4；(2)當病情發展，真菌孢子可以聚集成團塊狀，這種真菌孢子聚集的團塊大小不一，形態不規則，參見圖2～8，但其中可見大量密集聚集的孢子顆粒結構；(3)當病情進一步發展，孢子不斷聚集，還會疊加增厚，增厚嚴重的區域可以阻擋激光的進入，從而影響成像，參見圖[9-11]

將培養的菌落涂抹于角膜接觸帽的外表面，采用激光共焦顯微鏡進行觀察，可見大量、細小、顆粒狀的孢子聚集成團塊狀，形態不規則，參見圖12～13。活體近平滑酵母菌性角膜潰瘍灶中的孢子和培養涂片的孢子在角膜激光共焦顯微鏡圖像基本一致，說明角膜激光顯微鏡在檢查活體真菌孢子與涂片后培養的效果基本一致。

酵母菌的孢子非常細小，直徑常常在1 μm以下，如不進行HE染色，在顯微鏡下很難辨認，非常容易于取材時的雜質混淆。而我們常規角膜潰瘍刮片取材后，是加一滴3.9 mmol/l的氫氧化鉀溶液后，于顯微鏡下查找真菌菌絲及孢子，常規并不進行HE染色。同時還受限于實驗室檢查人員對病原菌形態學和生物學特點的認識，對于此類只有孢子而沒有菌絲的酵母菌非常容易漏診。我們掌握了該類孢子在共焦顯微鏡下的圖像特點后，采用共焦顯微鏡直接檢查角膜潰瘍灶，可以減少對這類單純孢子致病的真菌性角膜潰瘍的誤診和漏診。

臨床上采用共焦顯微鏡對潰瘍灶進行檢查時，應注意以下事項：(1)病灶檢查范圍至少應包括病灶的中央、周圍浸潤灶與透明角膜交界區的上、下、鼻和顳側5個檢查點；(2)在患者配合地情況下，共焦顯微鏡鏡頭最好繞潰瘍灶檢查一周，以免遺留死角；(3)潰瘍灶中角膜壞死碎屑較多，組織水腫嚴重，背景反光強時，應反復調整共聚焦顯微鏡的對焦平面，將孢子從強背景中區別開來，避免假陰性結果；(4)當潰瘍灶中的孢子較多時，可以脫落懸浮于潰瘍灶的積液中或者角膜上的小凹液體中，參見圖[14，15]，我們在進行共焦顯微鏡檢查時，如果發現這種情況，應在潰瘍灶處仔細檢查，以免漏診；(5)患者如使用過那他霉素滴眼液，藥物粉塵顆粒覆蓋在潰瘍灶表面會影響孢子的觀察，可以用生理鹽水將潰瘍灶表面的藥物粉塵沖洗后再進行檢查，以提高檢查的陽性率[2-14]。

角膜激光共焦顯微鏡在我國眼科的臨床應用較為廣泛，是早期診斷真菌性角膜潰瘍及指導臨床治療的新型設備儀器，其對真菌菌絲所致的角膜潰瘍診斷陽性率高，檢查時間短，同時對眼部組織無損傷，可以反復進行，有其特有優勢。而對于孢子致病的真菌性角膜潰瘍，臨床報道較少。近平滑假絲酵母菌是單純孢子致病的一類真菌，臨床上較為少見，同時致病孢子的直徑太小，容易與潰瘍灶中的雜質混淆。通過對比活體潰瘍灶中孢子特點和培養孢子在共焦顯微鏡下的特點，有助于我們減少對該類孢子致病的真菌性角膜潰瘍的漏診，提高診治水平。角膜激光共焦顯微鏡檢查活體真菌性角膜潰瘍的孢子與培養的效果基本一致，在孢子致病的真菌性角膜潰瘍的研究和臨床診斷方面是十分有用的工具[3-18]。