新型大鼠嚴重失血性休克模型的建立

劉 琳,王硯明?,趙惠民,賈東輝,劉 昱

(1.河北農業(yè)大學生命科學學院,河北 保定 071001;2.保定市第一醫(yī)院胸外科,河北 保定 071066;3.保定市第二醫(yī)院胸外科,河北 保定 071051)

失血性休克是一種外科常見的急危重癥,是由于急性失血量超過機體總循環(huán)血量的20%(五分之一)而引起血液灌流減少,導致細胞功能所需的氧氣和營養(yǎng)物質輸送不足,它是創(chuàng)傷病例中最常見的死亡原因,也是全球總壽命損失的主要原因[1-3]。在過去的幾十年中,人們已經做了大量的努力來闡明與嚴重出血相關的病理生理機制,已經建立了各種各樣的實驗條件,使研究人員能夠研究低血容量性休克的影響,并評估各種治療方案的潛在益處[4-8]。 然而,將這些實驗結果轉化為臨床應用的治療仍是一個挑戰(zhàn),部分原因可能是當前實驗中使用的動物模型[9-16]。 目前失血性休克的研究主要采用三種基本模型:定容出血模型、定壓出血模型和非控制性出血模型[17-20]。 這些模型至少有兩個缺點。 首先,廣泛的血壓波動導致了人們對實驗的標準化和重復性的考量;第二,短期嚴重低血壓很難引起組織損傷。 為了引起可靠的組織損傷,平均動脈壓(MAP)必須維持在一個較低的水平,并持續(xù)較長時間。 大量失血導致心臟供血迅速減少,引發(fā)高死亡率。 因此,在目前的模型中,出血發(fā)作時間通常太短(少于90 min),無法誘導組織損傷。 例如,Carrillo 等[21]、Capone 等[22]表明,在40 mm Hg 的MAP 下持續(xù)60 min 或30 mm Hg 的MAP 下持續(xù)45 min 的失血性休克不會對術后存活的大鼠造成細微的功能或組織學腦損傷,而將MAP 控制在30 mm Hg 的水平有可能導致心臟驟停。 此外,低血壓發(fā)作時間較短的動物模型顯然不能很好地模擬某些嚴重失血性休克患者持續(xù)出現(xiàn)的輕微神經行為缺陷的臨床表現(xiàn)[23]。 因此,我們開發(fā)了一種新型的大鼠失血性休克模型,可以克服這些缺點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠30 只,體重250~300 g,8~10 周齡,均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 將所有大鼠飼養(yǎng)在溫度22℃~25℃和濕度55%~65%的控制室內,光照和黑暗條件12 h 交替循環(huán),適應環(huán)境一周,期間可自由飲水和進食。 大鼠無菌手術實驗操作與組織取材均在河北醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心設施內進行[SYXK(冀)2018-005]。 本研究方案已通過河北農業(yè)大學生命科學學院機構動物保護和使用委員會批準(批準號SM20171)。 并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷、小動物麻醉機(深圳瑞沃德公司);肝素鈉注射液(江蘇萬邦公司);BL-420F 信號采集和分析系統(tǒng)(成都泰盟公司);血氣分析儀(ABL80 Flex,丹麥RADIOMETER)。

1.3 實驗方法

1.3.1 注射器儲血庫的連接方法

血液儲存裝置(注射器儲血庫)連接方法如圖1所示。 10 mL 注射器用作血液儲存器,將注射器固定在墻壁上,在外科手術板上方47.58 cm 處有0.0 mL 標記。 注射器血液儲存器回路用肝素溶液(12 000 U/mL)沖洗,防止凝血。

圖1 注射器儲血庫的連接Note. A, Syringe(10 mL). B, Baxter non-DEHP high-flow rate extension set(or 1.5-meter-long PE-190 tubing). C, Three-way stopcock. D, Connector to blood pressure transducer. E, 20-gauge needle. F, 20-gauge needle cap protector. G, 20 cm PE-50 tubing.The total prime volume in the circuit was approximately 2 mL.Figure 1 Connection of the syringe blood reservoir

1.3.2 模型制備

將大鼠麻醉,根據動物失去腳蹬反射(捏腳趾)證實麻醉狀態(tài)。 在整個休克期間,仔細監(jiān)測動物,如果有任何醒來的跡象,則加大麻醉氣體流量,重復麻醉。 監(jiān)測大鼠的直腸溫度,并在整個實驗過程中用手術燈加熱保持直腸溫度在(37±1)℃。 在無菌條件下,通過局部切口剝離右側股動脈,將PE-50管插入右側股動脈。 每只大鼠通過股動脈注射500 U/kg 肝素。 將PE-50 管進一步推進腹主動脈(從腹股溝韌帶到管尖端約1 cm 長),從腹主動脈導出血液到注射器血庫中來誘導休克,當血壓下降到所需水平時記錄出血性休克開始時間。 在休克期間,目標MAP 為35 mm Hg。 在失血性休克期間,必須上下移動注射器,使其與目標MAP 對應高度處的血液水平相匹配。 從理論上講,47.58 cm 高度處的血液水平在地球重力(1 mm Hg ≈1.3595 mm H2O)下產生35 mm Hg 壓力。 注射器儲血器內的血液作為反饋機制,有助于控制動脈血壓恒定,即當大鼠血壓升高時,它會自動放血到注射器儲液器中,當大鼠血壓下降時,它會自動回輸血液,以此維持整個休克發(fā)作期間的血壓穩(wěn)定。

1.3.3 觀察指標

在實驗期間連續(xù)監(jiān)測EKG。 將血壓傳感器連接到三通旋塞以測量血壓。 使用BL-420F 信號采集和分析系統(tǒng)獲得血壓和心率。 記錄最大失血量和最終失血量,即在3 h 休克期間注射器儲血庫中達到的最高血液水平和在失血性休克結束時的血液水平。 使用ABL80 Flex 血氣分析儀檢測出血前和休克結束后的酸堿度(pH 值)、乳酸(Lac)、氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)、血紅蛋白(Hct)。病理檢測:大鼠處死后,所有大鼠灌流10%福爾馬林緩沖液,在室溫下收集并固定大腦一周,石蠟包埋切片(4 μm)用蘇木精-伊紅染色,研究人員用雙盲法評估海馬神經元的組織病理學變化。

1.3.4 實驗分組

2 只大鼠進行假手術處理,僅測量股動脈血壓和心率,未引起失血性休克。 將剩余28 只大鼠隨機分為4 組(如表1),每組中的大鼠都經歷3 h 的失血性休克。 選擇這種失血性休克發(fā)作時長,是據報道提示短期和不太嚴重的失血性休克不會引起明顯的組織損傷[21-23]。 實驗結束時對所有大鼠實施安樂死,在正常體溫下腹腔注射200 mg/kg 戊巴比妥鈉。

表1 實驗分組(n=7)Table 1 Experimental grouping

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。 所有變量均以平均數(shù)±標準差(±s)表示。 統(tǒng)計學差異采用單因素方差分析,如若存在差異,則兩兩比較采用LSD-t檢驗。 在應用方差分析之前,使用Kolmogorov-Smirnov檢驗評估數(shù)據分布。 結果表明,所有參數(shù)數(shù)據均為正態(tài)分布。 采用Kaplan-Meier 生存分析和log-ran檢驗分析RN、RB、RR 組的大鼠生存時間。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義(雙尾)。 樣本量根據Capone 等[23]的研究中的失血性休克模型和Charan等[24]的動物數(shù)量計算方法計算。

2 結果

2.1 存活率

使用注射器儲血庫建立的大鼠失血性休克動物模型,在3 h 休克結束后所有大鼠均能存活(各組存活率100%)。 復蘇期斷開注射器血庫后,RB 組和RR 組復蘇后大鼠均能存活3 h。 然而,在RN 組中,存活率顯著降低(約14%,P<0.05),7 只大鼠中有6 只在失血性休克后25、28、45、50、60 和120 min死亡。 大鼠死亡定義為血壓低于15 mm Hg、呼吸喪失或心臟驟停。

2.2 血壓和心率

兩只接受假手術的大鼠,在整個實驗過程中,血液MAP 保持在110~125 mm Hg 之間,心率 保 持 在 260 ~ 276 bpm 之 間。 在 休 克 前(Baseline)或休克期間,實驗組之間的MAP 和心率沒有顯著差異。

所有組測得的血壓和心率值見表2 和表3。 在血液達到注射器的0.0 mL 標記后5 min 內,MAP 從基線下降到目標血壓。 在手術臺上方47.58 cm 處保持注射器儲血庫內的血液水平,HS、RN、RB、RR組的MAP 分別保持在(31.1±2.9)、(34.6±2.1)、(35.3±3.2)、(33.8±1.5)mm Hg(與休克前相比,P<0.05)。 失血性休克還導致各組心率顯著降低(與休克前相比,P<0.05)。

表2 平均動脈壓Table 2 Mean arterial blood pressure

表3 心率值Table 3 Heart rate

在沒有復蘇的情況下,當注射器儲血庫的血液通道關閉時,MAP 逐漸下降到0.0 mm Hg,導致7只大鼠中有6 只死亡。 對于一只存活的大鼠,實驗結束時MAP 非常低,約20 mm Hg(RN 組)。 在休克結束后,血液再輸注復蘇使得MAP 顯著增加至(90±21.2)mm Hg(RB 組)。 乳酸林格氏液復蘇后,實驗結束時血壓僅為(35.5±10.2)mm Hg。 復蘇RB 組MAP 值和心率顯著高于RR 組(P<0.05)。

2.3 血氣、乳酸和血紅蛋白濃度(Hct)

血氣、乳酸和Hct 數(shù)據見表4。 失血性休克后各組血pH 值和Hct 值均較休克前(Baseline)顯著降低(P<0.05),血乳酸值顯著升高(P<0.05),而PO2和PCO2均保持在正常范圍,與休克前相比無太大變化。

表4 血氣和乳酸含量Table 4 Blood gas and lactate

2.4 失血量

體重和失血量數(shù)據見表5。 失血性休克后20~30 min 出現(xiàn)最大失血量。 失血性休克期間最大失血量和最終失血量非常相接近。 以注射器中的出血量加上血液回路中的血液量(2 mL)計算失血量。

表5 體重和失血量Table 5 Body weight and blood loss

2.5 病理學評價

HE 染色后,光鏡觀察結果顯示,假手術的大鼠海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列規(guī)則,結構清楚,細胞層次豐富,神經元膜完整,細胞核形態(tài)正常。 失血休克(HS)組海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列較規(guī)則,細胞層次減少,部分神經元胞膜破裂,細胞萎縮。 未灌注(RN)組海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列較規(guī)則,細胞層次減少,大量神經元胞膜破裂,細胞萎縮。 血液灌注(RB)組海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列較規(guī)則,細胞層次減少,全部神經元胞膜破裂,細胞嚴重萎縮。乳酸林格氏液灌注(RR)組海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列不規(guī)則,細胞層次嚴重減少,全部神經元胞膜破裂,細胞嚴重萎縮。 (如圖2)。

圖2 大鼠海馬CA1 區(qū)蘇木精-伊紅染色Note. Twenty-eight rats were randomly divided into 4 groups. All groups were subjected to hemorrhagic shock for 3 hours (n=7 in each group). A, Rat that underwent the sham procedure with normal pyramidal cells. B, HS group. C, RN group. D, RB group.E, RR group. HS, Hemorrhagic shock for 3 hours. RN, Recovery by nothing. RB, Resuscitation by blood infusion. RR,Resuscitation by Ringer’s solution. Pyknotic hippocampal pyramidal neurons were shrunken with condensed and deeply stained nuclear chromatin (arrows).Figure 2 HE staining of rat hippocampus samples taken from the CA1 region

3 討論

Lamson 等[25]和Vivaldi 等[26]在20 世紀40 年代建立了一種能精確控制血壓的犬失血性休克模型。 然而,這種有價值的技術在很大程度上被忽視了。 值得注意的是,與使用大型動物相比,嚙齒動物的使用具有許多倫理和經濟上的優(yōu)勢。 本研究應用這種儲血技術來克服模擬失血性休克的嚙齒動物模型研究中的技術缺陷:血壓波動范圍大,并且難以維持長時間的嚴重失血性休克以誘發(fā)可靠的組織損傷。

在傳統(tǒng)的休克模型中,給動物放血直到動脈壓力達到預定水平,然后在必要時通過反復出血或輸液來手動維持壓力[27]。 然而,通常很難確定何時以及在多大程度上輸注或抽出血液。 手動控制血壓會導致顯著的血壓波動。 因此,傳統(tǒng)的“定壓”模型并沒有真正表現(xiàn)出定壓,因為缺乏有效的技術來控制廣泛的血壓波動。 在定容出血模型中,在不同的實驗中,30%~60%的估計血容量被放出,并且低血壓的程度沒有被正確定義。 大鼠失血量隨體重和每只大鼠的Hct 而變化[28]。 在計算休克時間之前,出血時間也因動物而異。 因此,目前的失血性休克模型總是遇到標準化和再現(xiàn)性的問題。 大量失血導致心臟供血迅速減少,導致高死亡率,從而顯著地限制了休克的持續(xù)時間。 為了在實驗中引起可靠的組織損傷,MAP 必須在一定時間內保持在較低的水平。 Stein 等[29]報告稱,持續(xù)不到20 min 的25~30 mm Hg MAP 不會對大鼠造成危及生命的器官損傷。 Hoppen 等[30]報告,45 mm Hg 的MAP 持續(xù)60 min 不會對大鼠造成嚴重損害。 此外,研究表明,在40 mm Hg 的MAP 下持續(xù)60 min 或30 mm Hg 的MAP 下持續(xù)45 min 的失血性休克不會導致輕微的功能或組織學腦損傷[21-23]。

通過新設計的注射器儲血庫裝置,能夠準確地控制血壓而無波動。 在3 h 失血性休克發(fā)作期間,MAP 準確地維持在31~35 mm Hg 左右(表2)。 休克發(fā)作時,只需監(jiān)測注射器血庫內的血液水平,并上下移動注射器,使血液水平高于大鼠身體(心臟位置)47.58 cm。 理論上,由于重力作用,大鼠身體上方47.58 cm 處的血液水平產生了35 mm Hg 的壓力。 根據預先確定的血壓自動調節(jié)輸注或輸出。因此,血壓波動很小。 從技術上講,可能會出現(xiàn)輕微的血壓波動,但只有在延遲移動注射器以使儲液器內的血液水平較長時間保持高于大鼠身體上方47.58 cm 時才會發(fā)生。 恒定的MAP 保證了基本的心臟供血,失血性休克期可輕松維持3 h,PO2和PCO2保持也在正常范圍內(表4)。 鑒于血液再輸注后MAP 恢復到(90±21.2)mm Hg(RB 組,表2),因此認為在該模型中心肺功能相對保持或有恢復的潛力。 很可能我們的注射器血庫抵消了血壓下降,從而阻止了冠狀動脈血流的顯著減少。 在整個3 h 的休克過程中,最大失血量和最終失血量非常接近,大約在9.2~9.4 mL 之間。 大鼠血流量約為50~70 mL/Kg[30]。 對于體重約250 g 的大鼠,該模型中的失血量至少相當于循環(huán)血流量的60%。 因此,該模型不僅是定壓模型,而且是定容模型。 經過如此長時間的嚴重失血性休克后,能夠在所有的實驗組中發(fā)現(xiàn)明顯的腦損傷。 海馬組織對缺血缺氧比較敏感,其損傷時的特征是大量的神經元固縮,如圖2 所示。 失血性休克3 h 導致該模型嚴重乳酸酸中毒(表4,顯著降低血pH 值和乳酸升高)。7 只未復蘇的大鼠中有6 只在3 h 失血性休克發(fā)作后120 min 內死亡(RN 組),但所有失血后經過液體復蘇的大鼠在整個實驗期間均可存活(RB 組和RR組)。 這意味著盡管有嚴重的出血,這個模型依然是可以救治的。

總之,利用注射器血庫建立的高重復性失血性休克模型可以成為研究失血性休克的病理生理變化、器官、組織損傷和治療效果的非常有用的工具。