芹菜素對帕金森模型細胞氧化應激水平的影響及機制的研究

張躍其,胡炳蕾,王默然,馬海強,張 君,陳學叢?

(1.濰坊市人民醫院神經內科,山東 濰坊 261000;2.濰坊市中醫院婦科,山東 濰坊 261000;3.濰坊市中醫院老年科,山東 濰坊 261000;4.濰坊市中醫院骨科,山東 濰坊 261000;5.山東第一醫科大學第一附屬醫院神經內科,濟南 250013)

帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是一種神經退行性疾病,主要表現為靜息性震顫、姿勢異常、肢體僵硬和運動障礙,60 歲以上的人群中患病率約為1%[1],而未來20 年罹患人數將增加一倍,全世界PD 患者預計將超過1400 萬[2],因此,針對PD 治療措施的研究具有重要的社會及臨床意義。PD 的神經化學特征包括活性氧生成、線粒體功能障礙、炎癥、錯折疊蛋白的積累和泛素蛋白酶體系統功能障礙。 目前研究發現自噬途徑調控異常在PD 的發生發展過程中發揮著重要作用[3],其參與了PD 患者中多種病理過程,最終出現清除受損蛋白質和/或細胞器功能異常。

芹菜素(4’、5、7-三羥基黃酮,apigenin, AGN)是存在于水果和蔬菜(例如洋蔥,橙子)中的類黃酮的一個子類[4],而類黃酮可以保持黑質紋狀體的完整性和功能性[5]。 AGN 在各種細胞類型中具有多種生物活性,例如抗氧化、抗炎和抗腫瘤發生[4]。研究發現AGN 可保護腦神經血管抵抗淀粉樣蛋白-β25-35誘導的小鼠神經毒性[6],此外AGN 可預防小膠質細胞介導的炎癥毒性,并維持適當的神經膠質神經元相互作用[7]。 AGN 可以作為潛在的神經保護劑來對抗與PD 相關的病理過程[4]。 自噬是細胞降解自身受損細胞器和大分子物質的生理過程,其與PD 的發展密切相關[8],目前尚未有關于AGN 對PD 細胞模型中的神經保護作用及自噬影響的報道。 因此,在本研究中,我們研究了AGN 對MPP+誘發的PD 模型中細胞自噬、氧化應激的影響及神經保護作用,為新的PD 臨床治療措施提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞

人神經母細胞瘤SH-SY5Y 細胞購自美國ATCC(ATCC-CRL-2260TM)公司。

1.2 主要試劑與儀器

芹菜素購自Sigma-Aldrich 公司(純度98%,12806KH);胎牛血清(FBS)以及DMEM 培養基購自美國Gibco 公司;鏈霉素及青霉素購自美國Invitrogen 公司;CCK-8 試劑盒購自上海碧云天公司;凋亡檢測試劑盒購自法國Transgene 公司;Capase-3 兔單克隆抗體、Bcl-2 兔單克隆抗體及Beclin 兔單克隆抗體購自美國Abcam 公司;LC3-II兔單克隆抗體、Bax 兔單克隆抗體、ULK1 兔單克隆抗體、β 單克隆抗體-鼠單克隆抗體購自美國CST公司;二抗及ECL 發光試劑盒購自上海碧云天公司;PVDF 膜購自美國Millipore;蛋白電泳系統購自北京六一儀器廠;酶標儀購自美國Bio-Rad;激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica 公司;流式細胞儀購自美國BD(FACSAria III)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

SH-SY5Y 細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM 培養基中。 細胞培養箱孵育條件為37℃、5% CO2。 細胞密度90%時胰酶消化傳代,按照每孔2×103個細胞接種到96 孔板進行后續相關實驗。

1.3.2 CCK-8 篩選AGN 有效濃度

以CCK-8 法檢測細胞活力。 向每孔加入CCK-8 溶液20 μL,將培養板在培養箱中孵育2 h,用酶標儀測定450 nm 處的吸光度,計算細胞活性。 實驗重復3 次。 本部分實驗分6 組:①對照組:DMEM 培養基;②MPP+組:DMSO(濃度0.5%)+2.5 mmol/L 的MPP+誘導細胞24 h;③A 組:加入AGN 孵育細胞2 h 后再加入MPP+,AGN 終濃度10 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;④B 組:AGN 終濃度20 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑤C 組:AGN 終濃度40 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L;⑥D 組:AGN 終濃度100 μmol/L,MPP+終濃度2.5 mmol/L。

1.3.3 細胞凋亡率檢測

確定AGN 有效濃度后,將細胞分為3 組:對照組、MPP+組及芹菜素有效劑量組。 采用AnnexinV與PI 共染法檢測細胞凋亡。 將細胞培養于96 孔板,每孔加入Annexin V-FITC 結合液,輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻,室溫(25℃)避光孵育20 min,隨后置于冰浴中,用流式細胞儀FITC 和PI 通道檢測細胞凋亡。 實驗重復3 次。

1.3.4 蛋白質免疫印跡檢測

收集細胞經勻漿后,經RIPA 法裂解提取蛋白。超聲裂解儀裂解10 次后低溫離心機中離心30 min,取上清并用BCA 法定量蛋白濃度,蛋白經SDSPAGE 電泳后電轉至PVDF 膜,脫脂牛奶搖床上封閉1 h,加入一抗后置4℃恒溫搖床過夜。 洗膜3 次后室溫孵育二抗1 h,利用化學發光試劑盒顯影蛋白條帶,采用Image-J 軟件分析定量蛋白條帶,β-actin為內參。 實驗重復3 次。

1.3.5 氧化應激檢測

分別收集3 組細胞到離心管內,離心后超聲波破碎細胞,4℃離心10 min 后取上清,采用丙二醇(malonaldehyde, MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)檢測試劑盒用來檢測各組中氧化應激相關底物的改變,分光光度計檢測吸光度,具體方法參照試劑盒說明書。 每組實驗均重復3 次。

1.3.6 GFP-LC3 質粒轉染

將SH-SY5Y 細胞按照每孔2×105個接種6 孔板,每孔轉染2 μg GFP-LC3 質粒,孵育6 h 更換新培養基,加入相應的藥物處理24 h 后進行GFP-LC3斑點計數分析。 在胞漿及胞核中GFP-LC3 散在分布的細胞為自噬陰性細胞,出現GFP-LC3 斑點聚集的為自噬陽性細胞,各組計數至少100 個自噬陽性細胞中的GFP-LC3 斑點。 于激光共聚焦顯微鏡下掃描轉染細胞。 實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21 軟件進行統計分析。 計量資料用平均數±標準差(±s)表示,多樣本均數的比較采用ANOVA 分析檢驗,事后各組間的兩兩比較采用Tukey 法,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AGN 對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞的保護作用

本實驗首先通過CCK-8 法對AGN 的有效保護濃度進行篩選。如圖1所示, 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L 三種濃度的AGN 能顯著降低MPP+誘導的細胞毒性損傷,細胞活性明顯改善(相較MPP+組,P值分別<0.05、<0.01、<0.01)。AGN 濃度在40 μmol/L 時保護作用最強,選擇40 μmol/L 作為最佳藥物保護濃度進行后期實驗研究。

圖1 不同劑量AGN 對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞活性的影響Note. Compared with the MPP+ group, ?P <0.05, ??P <0.01.Figure 1 Effects of different doses of AGN on the viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.2 AGN 對MPP+誘導模型細胞凋亡及凋亡相關蛋白的影響

后續實驗分為3 組:對照組、MPP+組、AGN+MPP+組(AGN 40 μmol/L)。 如圖2A、2B 所示,MPP+組細胞凋亡率為11.03%,較對照組升高(P<0.01);AGN+MPP+組細胞凋亡率為6.12%,較MPP+組下降(P<0.05)。 隨后我們比較了各組Caspase3 及Bcl-2、Bax 蛋白的表達。 如圖2C、2D 所示,相較于對照組,MPP+組細胞Caspase3 表達明顯升高,Bcl-2/Bax 值明顯降低(P<0.01);而AGN+MPP+組相較MPP+組,Caspase3 表達降低,Bcl-2/Bax 值明顯升高(P<0.01)。 以上結果表明AGN 可改善MPP+誘導的細胞凋亡。

圖2 AGN 對細胞模型凋亡及凋亡相關蛋白的影響Note. A, Apoptotic rate of each group was detected by flow cytometry. B, Comparison of cell apoptosis rate in each group,Compared with control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of Caspase3, Bcl-2 and Bax protein in each group. D, Comparison of the relative level of Caspase3 and Bcl-2/Bax value in each group. Compared with Control group,??P<0.01. Compared with MPP+ group, ##P<0.01.Figure 2 Effect of AGN on cell apoptosis and apoptosis-related proteins

2.3 AGN 對MPP+誘導模型細胞氧化應激的影響

進一步檢測各組中氧化應激相關底物表達及酶活性。 和對照組相比,MPP+促進了MDA 表達(P<0.01),而與MPP+組比較AGN 可抑制MDA 的表達(P<0.05)。 和對照組相比,MPP+組細胞GPX和SOD 活性降低,而與MPP+組比較AGN 能恢復GPX 和SOD 的活性(P<0.05)。 見圖3。

圖3 AGN 對模型細胞氧化應激的影響Note. Compared with Control group, ?P<0.05, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.01.Figure 3 Effect of AGN on oxidative stress of model cells

2.4 AGN 對MPP+誘導模型細胞GFP-LC3 斑點形成及自噬蛋白的影響

為進一步明確AGN 對MPP+誘導模型細胞自噬的影響,我們進行了GFP-LC3 斑點形成實驗。GFP-LC3 斑點作為胞漿內的自噬標志物,可以反映出自噬體對LC3 蛋白的募集情況。 將GFP-LC3 質粒轉染SH-SY5Y 細胞,結果顯示MPP+組細胞內GFP-LC3 斑點較對照組顯著增多(P<0.01),而AGN+ MPP+組細胞內GFP-LC3 斑點較MPP+組顯著減少(P<0.05)。 見圖4A、4B。 隨后我們觀察了LC3、Beclin-1 及ULK-1 蛋白的表達水平。 MPP+處理后,LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1 表達較對照組顯著增加(P值均<0.01);而對比MPP+組,AGN+MPP+組LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK1表達顯著降低(P值均<0.05),見圖4C、4D。 以上結果進一步證明了AGN 可顯著降低MPP+誘導模型細胞的自噬體形成及自噬水平。

圖4 AGN 對GFP-LC3 斑形成及自噬蛋白的影響Note. A, GFP-LC3 spots in each group observed by the confocal laser microscope. B, Comparison of GFP-LC3 spots in each group.Compared with control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05. C, Western blot was used to detect the expression of LC3, Beclin-1 and ULK1 proteins in each group. D, Comparison of the LC3-II/LC3-I ratio and the expression of Beclin-1, ULK1 in each group. Compared with Control group, ??P<0.01. Compared with MPP+ group, #P<0.05.Figure 4 Effect of AGN on GFP-LC3 plaque formation and autophagy protein

3 討論

PD 病理特征是黑質中的多巴胺能神經元逐漸喪失,隨后紋狀體中多巴胺水平下降,當神經元減少50%~70%時會表現出臨床癥狀[9]。 目前研究證實氧化應激是PD 致病機制的重要因素,導致線粒體穩態失調,進而出現細胞凋亡、神經元減少[10]。在本研究我們發現AGN 能減輕MPP+誘導的SHSY5Y 細胞凋亡,增強抗氧化能力,并能降低細胞自噬水平,提示AGN 對帕金森模型細胞的保護作用與降低細胞自噬水平相關。

氧化應激在PD 中的神經變性改變起著關鍵作用,可促炎性細胞因子、活性氧(ROS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)以及超氧化物的釋放而加速神經退行性過程,加劇了多巴胺能神經元的損傷[10-11]。PD 患者紋狀體和黑質致密部的尸檢表明,氧化應激會損害脂質、蛋白質和DNA 功能,同時降低SOD、過氧化氫酶和GPX 的含量[12-14]。 SOD 和GPX 是清除活性氧自由基的主要酶,其水平降低會使細胞更容易受到氧化損傷[13]。 PD 患者GPX、SOD 顯著耗竭,蛋白質及DNA 氧化水平顯著增加[15]。 人體解剖數據表明,氧化應激的啟動最終導致神經元死亡[14]。 另一項臨床研究表明,PD 患者黑質多巴胺能神經元的核因子kB(NF-κB)的核易位倍數增加,并且NF-κB 由氧化應激觸發,放大了炎癥和凋亡程序的過程[16]。 因此,具有神經保護、抗氧化效能的藥物具有減緩神經變性進程的潛力,有助于促進神經元細胞存活,從而減輕疾病表現。 在各種PD 實驗模型中,用抗炎藥抑制神經炎癥可減輕多巴胺能神經退行性變[17]。

在本研究中,AGN 作用下SOD、GPX、MDA 水平的改變證實了AGN 對PD 模型細胞具有很好抗氧化應激作用。 AGN 是多種植物中存在的多酚類物質,已知其具有多種生理益處,尤其是在清除自由基、改善認知障礙、改善學習和記憶方面[18]。 有研究對AGN 在轉基因帕金森果蠅模型中的治療效能進行了檢測,發現其可改善果蠅的運動能力[19]。 對小膠質細胞的研究證明,AGN 對炎性介質具有抑制作用,表明其在神經退行性疾病中可能具有神經保護作用[18]。 另一項研究表明AGN 能促進成年小鼠的神經發生,提示其具備神經保護和神經營養能力[20]。

自噬是一種降解和回收細胞組分的溶酶體依賴性的內源性過程,目前已經證實其與PD 的發生發展密切相關[3]。 在本研究中,AGN 在帕金森模型細胞中可抑制LC3-II/LC3-I 比值及Beclin-1、ULK-1,并抑制LC3 斑點形成,減輕自噬水平。 MPP+是線粒體呼吸鏈復合體的抑制劑,MPP+可模擬PD 病理過程,其誘導的氧化損傷類似于PD 患者大腦中發現的氧化損傷,損害細胞線粒體功能,而這會觸發細胞自噬水平[21]。 此外,在PD 患者中線粒體膜上a-Syn 過度積累可導致心磷脂暴露于線粒體外膜,從而募集LC3 連接蛋白,誘導線粒體自噬[22]。Zhu 等[23]在2012 年的一項研究發現,加入ERK 信號通路特異性抑制劑可抑制MPP+導致的自噬水平升高。 以UO126 抑制MPP+所致的自噬水平升高,會出現線粒體膜電位水平升高,線粒體活性氧水平降低[24]。 半胱氨酰白三烯受體拮抗劑可同步抑制花生四烯酸相關的炎性應激及自噬水平,從而保護神經元,發揮對全腦缺血的治療作用[25]。 與上述研究類似,本研究中MPP+可增強自噬及氧化應激水平,而AGN 可抑制自噬及氧化應激水平。 UNC51樣激酶(ULK1)是啟動自噬級聯反應的絲氨酸/蘇氨酸激酶。 研究發現,miR-132-5p 可靶向抑制ULK1,改善細胞活力并減少MPTP 誘導的SHSY5Y 細胞凋亡[26],百可利能抑制ULK1 蛋白過度活化,減輕自噬水平,使帕金森模型小鼠紋狀體中酪氨酸羥化酶表達上調,改善小鼠的運動障礙[27]。另一項研究表明,在MPP+處理的MN9D 細胞中ULK1 表達增加,而敲低ULK1 則增加了神經元細胞的活力[28]。 本研究中AGN 抑制了MPP+誘導的ULK1 表達增高,結合前述研究結果分析,AGN 可能是通過調控自噬通路影響了線粒體的氧化應激,進而發揮細胞保護作用。

綜上,我們的結果表明,AGN 能緩解MPP+誘導的氧化應激,減輕細胞凋亡,降低細胞自噬水平。本研究揭示了AGN 可能通過影響自噬來降低氧化應激水平,從而減弱了MPP+介導的毒性,發生細胞保護作用。 但由于氧化應激的復雜性及自噬調控的多樣性,AGN 調控自噬及氧化應激的具體分子機制仍需我們進一步研究,為PD 的轉化治療應用提供更多理論依據。