黃芪皂苷Ⅱ對哮喘幼年大鼠IL-21/STAT3 通路及氣道炎癥反應的影響

伍 爽,李 微,黎 達,辛 迪,陳曉鳳,李 雪

(1.齊齊哈爾市第一醫院新生兒科,黑龍江 齊齊哈爾 161000;2.哈爾濱市道里區人民醫院兒科,哈爾濱 150000)

哮喘是嬰幼兒常見的呼吸系統疾病之一,是由多種免疫活性細胞及炎癥介質參與的慢性疾病[1-3]。 其主要特征是氣道炎癥、氣道高反應性、黏液生成增加和嗜酸性粒細胞浸潤[4]。 黃芪是補益中藥,具有健脾補中、升陽舉陷、托毒生肌之功效,《本草綱目》 記載“可治一切氣衰血虛之癥”[5]。 其中,黃芪皂苷Ⅱ是黃芪重要的生物活性成分,具有免疫調節、抗腫瘤等生物活性[6-7]。 白細胞介素21(interleukin-21,IL-21)可介導多種生物學效應,與其受體IL-21R 結合后可通過信號傳導途徑Janus 激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉導和轉錄活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)傳遞活化信號[8-9]。 He 等[10]研究發現,麻黃湯在大鼠哮喘模型中可有效緩解氣道炎癥并調節IL-21/STAT3 信號通路。 但目前,關于黃芪皂苷Ⅱ是否可通過IL-21/STAT3 信號通路,改善哮喘癥狀尚未見報道。 因此,本研究以哮喘幼年大鼠為研究對象,探討黃芪皂苷Ⅱ對哮喘幼年大鼠IL-21/STAT3 通路及氣道炎癥反應的影響,為黃芪皂苷Ⅱ為在臨床幼兒哮喘中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

72 只新生SD 幼年大鼠,雌雄兼有,SPF 級,3~4 周齡,體重70~100 g,購自吉林大學實驗動物中心[SCXK(吉)2019-0001],大鼠飼養于齊齊哈爾醫學院動物實驗中心[SYXK(黑)2019-0017]。 飼養環境:溫度(25±2)℃,濕度50%,正常飲食,光照明/暗(12/12)h。 實驗嚴格遵循3R 原則。 本研究經齊齊哈爾市第一醫院倫理委員會批準(IACUC-2019 倫審第89 號)。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪皂苷Ⅱ(原料藥,純度98%,北京索萊寶科技有限公司,批號SA8620);地塞米松(原料藥,純度99%,武漢貝爾卡生物醫藥有限公司,批號50-02-2);卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)(美國sigma 公司,批號A5253、A6904);白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-21(interleukin-21,IL-21)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(美國Invitrogen 公司,批號RC0067、RK0947、RK1007);蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量測定試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)、超敏ECL 化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號SF-1397、DK-0993、FFP32、P0018 S);IL-21、STAT3、磷酸化-STAT3(phosphorylation-stat3,p-STAT3)、GAPDH 抗體、羊抗鼠二抗(美國Abcam 公司,批號ab178694、 ab5904、 ab5916、 ab00134、 ab0788 )。402AI 型超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備有限公司);FinePointe NAM 型動物肺功能檢測儀(美國Buxco 公司);MM800 型光學顯微鏡(日本Nikon 公司);1703940 型蛋白電泳儀(美國Bio-Rad 公司);GIS-500 型凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及哮喘模型建立

將72 只幼年大鼠按隨機數表法分成:對照組、模型組、黃芪皂苷Ⅱ低、中、高劑量組和地塞米松組,每組12 只。 參照文獻[11]進行幼年大鼠哮喘模型構建:各造模組(除對照組外)在建模第1 天,大鼠腹腔注射OVA 混懸液(0.2 mL)致敏,OVA 混懸液的組成為OVA(20 μg)和氫氧化鋁凝膠(2 mg),此后在第8 天和第15 天各進行此致敏操作1 次,于建模第16 天,大鼠給予4% OVA 的生理鹽水霧化吸入激發,持續進行7 d。 對照組將致敏藥物換成生理鹽水也按照上述方法進行處理。 每次激發完成后1 h,黃芪皂苷Ⅱ低、中、高劑量組、地塞米松組分別腹腔注射0.3 mg/kg 黃芪皂苷Ⅱ、0.6 mg/kg 黃芪皂苷Ⅱ、0.9 mg/kg 黃芪皂苷Ⅱ[12]、0.2 mg/kg 地塞米松[13],對照組和模型組腹腔注射生理鹽水,注射體積10 mL/kg。

1.3.2 氣道反應性測定

末次OVA 刺激24 h 后,各組幼年大鼠分別吸入6.25、12.5、25、50 mg/mL 的Ach 溶液50 μL,每個劑量連續記錄3 min 的增強呼氣間歇(Penh)值,測定其氣道反應性[14]。

1.3.3 樣本采集

麻醉大鼠,取血,收集血清,-80℃保存備用。取1 mL 生理鹽水進行肺部灌洗,收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),離心后收集上清液,置于-80℃中保存備用,將底部細胞涂片后,Diff-Quik 染色,高倍鏡下進行細胞分類計數。

解剖大鼠,取左肺置于甲醛溶液(10%)固定,取右肺剪碎,液氮速凍,-80℃保存。

1.3.4 BALF 中炎性因子測定取1.3.3 收集的BALF 上清液和血清,采用ELISA 試劑盒檢測IL-6、IL-21、TGF-β1 含量。

1.3.5 幼年大鼠肺組織病理學檢測

將固定在甲醛中的肺組織制成石蠟組織切片,蘇木素-伊紅(HE)染色后光學顯微鏡下觀察。 參照Henderson 等[15]方法對肺組織周圍炎癥因子進行浸潤評分,0 分:無炎性細胞;1 分:少許炎性細胞;2分:炎性細胞較多分布不均;3 分:大量炎性細胞,可見成團分布;4 分:大量炎性細胞聚集成團。

1.3.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測幼年大鼠IL-21、STAT3 蛋白表達水平測定

取出部分凍存在-80℃中的肺組織,勻漿化,提取總蛋白,檢測蛋白質濃度,取40 μg 蛋白上樣,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉移到PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h,將膜在4℃下與IL-21(1 ∶1000)、STAT3(1 ∶1000)、p-STAT3(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶2000)一抗孵育過夜,磷酸緩沖液洗滌膜,然后加入羊抗鼠二抗(1 ∶5000)37℃室溫孵育2 h,使用超敏ECL 化學發光試劑盒將蛋白質可視化,凝膠成像儀觀察條帶并拍照。 以GAPDH 為內參蛋白。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪皂苷Ⅱ對幼年大鼠氣道反應性測定的影響

不同濃度Ach 激發后,與對照組相比,模型組幼年大鼠Penh 值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪皂苷Ⅱ各處理組幼年大鼠Penh 值顯著降低(P<0.05);且隨著黃芪皂苷Ⅱ劑量的增加,幼年大鼠Penh 值依次降低(P<0.05)。 見表1。

表1 各組幼年大鼠不同濃度Ach 激發后Penh 值的比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of Penh values after Ach stimulation at different concentrations in each group of young rats

表1 各組幼年大鼠不同濃度Ach 激發后Penh 值的比較(±s,n=12)Table 1 Comparison of Penh values after Ach stimulation at different concentrations in each group of young rats

注:與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與黃芪皂苷Ⅱ低劑量組相比,cP<0.05;與黃芪皂苷Ⅱ中劑量組相比,dP<0.05。 下同。Note. Compared with the control group, aP<0.05. Compared with the model group, bP<0.05. Compared with the Astragaloside Ⅱlow-dose group, cP<0.05. Compared with the Astragaloside Ⅱmedium-dose group, dP<0.05. The same as below.

分組Groups不同濃度Ach 激發后Penh 值Penh values of different concentrations of Ach after excitation 6.25 mg/mL 12.5 mg/mL 25 mg/mL 50 mg/mL對照組Control group 1.14±0.18 1.58±0.09 1.97±0.13 2.56±0.25模型組Model group 3.04±0.37a 3.53±0.29a 3.95±0.31a 4.61±0.41a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 2.61±0.15b 3.10±0.25b 3.67±0.12b 4.15±0.34b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 1.95±0.25bc 2.47±0.17bc 3.13±0.19bc 3.69±0.28bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 1.38±0.16bcd 1.89±0.21bcd 2.54±0.22bcd 3.27±0.26bcd地塞米松組Dexamethasone group 1.32±0.19bcd 1.82±0.18bcd 2.31±0.17bcd 3.17±0.22bcd

2.2 黃芪皂苷Ⅱ對BALF 中炎性細胞數量的影響

與對照組相比,模型組幼年大鼠BALF 中白細胞總數和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數顯著升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪皂苷Ⅱ各處理組幼年大鼠BALF 中白細胞總數和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數顯著降低(P<0.05);且隨著黃芪皂苷Ⅱ劑量的增加,幼年大鼠BALF 中白細胞總數和嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數依次降低(P<0.05)。 見表2。

表2 各組幼年大鼠BALF 中細胞分類及計數結果(±s,n=12)Table 2 Cell classification and counting results in BALF of young rats in each group

表2 各組幼年大鼠BALF 中細胞分類及計數結果(±s,n=12)Table 2 Cell classification and counting results in BALF of young rats in each group

分組Groups白細胞總數(×104 cells/mL)Total white blood cell count嗜酸性粒細胞(×104 cells/mL)Eosinophils中性粒細胞(×104 cells/mL)Neutrophils淋巴細胞(×104 cells/mL)Lymphocyte巨噬細胞(×104 cells/mL)Macrophage對照組Control group 17.85±2.14 0.00±0.12 0.00±0.16 0.27±0.18 4.5±0.84模型組Model group 277.34±20.51a 178.36±7.47a 4.75±0.49a 52.38±5.97a 38.41±1.42a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 189.42±21.18b 132.95±11.34b 3.84±0.73b 39.81±8.43b 35.31±1.25b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 137.68±18.35bc 91.83±8.57bc 2.15±0.58bc 26.65±5.51bc 31.76±1.17bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 73.54±14.62bcd 62.19±7.62bcd 1.03±0.34bcd 19.72±3.27bcd 30.15±1.03bcd地塞米松組Dexamethasone group 68.43±10.45bcd 56.51±5.29bcd 0.93±0.47bcd 17.98±2.18bcd 28.67±1.05bcd

2.3 黃芪皂苷Ⅱ對各組幼年大鼠BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGF-β1 含量的影響

與對照組比,模型組各組幼年大鼠BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGF-β1 含量顯著升高(P<0.05);與模型組比,黃芪皂苷Ⅱ各處理組幼年大鼠BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGFβ1 含量顯著降低(P<0.05);且隨著黃芪皂苷Ⅱ劑量的增加,幼年大鼠BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGF-β1 含量依次降低(P<0.05)。 見表3、表4。

表3 各組幼年大鼠BALF 上清液中炎性細胞因子含量比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in BALF supernatant of each group

表3 各組幼年大鼠BALF 上清液中炎性細胞因子含量比較(±s,n=12)Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in BALF supernatant of each group

分組Groups白細胞介素-6(ng/L)IL-6白細胞介素-21(ng/L)IL-21轉化生長因子-β1(ng/L)TGF-β1對照組Control group 14.36±1.84 17.93±1.03 15.43±1.48模型組Model group 83.72±6.34a 97.56±4.63a 78.62±5.31a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 64.97±7.12b 71.42±4.87b 69.91±3.28b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 56.43±5.82bc 59.14±2.98bc 53.49±4.09bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 38.77±3.49bcd 42.35±2.13bcd 38.47±2.56bcd地塞米松組Dexamethasone group 36.84±2.19bcd 37.73±1.56bcd 30.15±2.08bcd

表4 各組幼年大鼠血清中炎性細胞因子含量比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of inflammatory cytokines in serum of young rats in each group

表4 各組幼年大鼠血清中炎性細胞因子含量比較(±s,n=12)Table 4 Comparison of inflammatory cytokines in serum of young rats in each group

分組Groups白細胞介素-6(ng/L)IL-6白細胞介素-21(ng/L)IL-21轉化生長因子-β1(ng/L)TGF-β1對照組Control group 11.83±1.53 13.94±1.62 15.64±1.17模型組Model group 85.46±7.01a 76.32±5.95a 83.29±6.54a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 74.25±5.26b 58.46±4.33b 61.47±4.21b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 47.64±4.68bc 41.75±4.02bc 49.38±3.86bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 28.31±2.54bcd 36.82±3.28bcd 35.61±4.03bcd地塞米松組Dexamethasone group 23.86±3.05bcd 34.34±2.81bcd 32.75±2.59bcd

2.4 黃芪皂苷Ⅱ對各組幼年大鼠肺組織病理損傷的影響

HE 染色后,光學顯微鏡下可觀察到:對照組幼年大鼠肺組織細胞排列整齊,結構完整,支氣管平滑肌厚度正常,未見明顯的炎性細胞浸潤;模型組肺組織可見幼年大鼠肺組織結構異常,支氣管上皮細胞脫落、水腫,管壁增厚,管腔狹窄,腔內有大量炎性細胞和黏液浸潤;黃芪皂苷Ⅱ各處理組和地塞米松組幼年大鼠支氣管上皮組織結構較為整齊清晰,管腔內炎性細胞浸潤減小,管壁厚度趨于正常。與對照組相比,模型組幼年大鼠肺組織炎癥評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪皂苷Ⅱ各處理組幼年大鼠肺組織炎癥評分顯著降低(P<0.05);且隨著黃芪皂苷Ⅱ劑量的增加,幼年大鼠肺組織炎癥評分依次降低(P<0.05)。 見表5、圖1。

圖1 各組肺組織HE 染色結果Note. A, Control group. B, Model group. C, Astragaloside Ⅱlow-dose group. D, AstragalosideⅡmedium-dose group. E, Astragaloside Ⅱhigh-dose group. F, Dexamethasone group.Figure 1 HE staining results of lung tissue in each group

表5 各組幼年大鼠肺組織炎癥評分(±s,n=12)Table 5 Lung inflammation score of young rats in each group

表5 各組幼年大鼠肺組織炎癥評分(±s,n=12)Table 5 Lung inflammation score of young rats in each group

分組Groups 炎癥評分(分)Inflammation score對照組Control group 0.00±0.00模型組Model group 3.95±0.24a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 2.54±0.31b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 1.39±0.28bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 0.85±0.22bcd地塞米松組Dexamethasone group 0.69±0.14bcd

2.5 黃芪皂苷Ⅱ對各組幼年大鼠肺組織IL-21、STAT3 蛋白水平的影響

與對照組相比,模型組幼年大鼠肺組織IL-21、p-STAT3 蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,黃芪皂苷Ⅱ各處理組幼年大鼠肺組織IL-21、p-STAT3 蛋白水平顯著降低(P<0.05);且隨著黃芪皂苷Ⅱ劑量的增加,幼年大鼠肺組織IL-21、p-STAT3蛋白水平依次降低(P<0.05)。 見圖2,表6。

圖2 各組幼年大鼠肺組織蛋白印跡圖Note. A, Control group. B, Model group. C, AstragalosideⅡlow-dose group. D,Astragaloside Ⅱmedium-dose group.E, Astragaloside Ⅱhigh-dose group. F, Dexamethasone group.Figure 2 Western blot of lung tissue of young rats in each group

表6 各組幼年大鼠肺組織IL-21、STAT3 蛋白表達水平檢測結果(±s,n=12)Table 6 Detection results of IL-21 and STAT3 protein expression in lung tissue of young rats in each group

表6 各組幼年大鼠肺組織IL-21、STAT3 蛋白表達水平檢測結果(±s,n=12)Table 6 Detection results of IL-21 and STAT3 protein expression in lung tissue of young rats in each group

分組Groups IL-21/GAPDH p-STAT3/STAT3對照組Control group 0.18±0.04 0.25±0.05模型組Model group 2.03±0.43a 1.98±0.37a黃芪皂苷Ⅱ低劑量組Astragaloside Ⅱlow-dose group 1.15±0.27b 1.07±0.29b黃芪皂苷Ⅱ中劑量組Astragaloside Ⅱmedium-dose group 0.84±0.19bc 0.74±0.15bc黃芪皂苷Ⅱ高劑量組Astragaloside Ⅱhigh-dose group 0.39±0.06bcd 0.46±0.08bcd地塞米松組Dexamethasone group 0.25±0.09bcd 0.38±0.07bcd

3 討論

哮喘是一種以氣道炎癥、支氣管高敏感性為特征的慢性疾病[16]。 哮喘氣道炎癥反應往往伴隨各種炎癥因子如IL-6、TGF-β1 等水平上調。 研究發現,地塞米松對哮喘具有明顯的治療作用[13],因此我們選用地塞米松作為本研究的陽性對照藥物。血清中炎性因子IL-6、IL-21 和TGF-β1 及BALF 上清液中白細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數量的檢測可用來觀察哮喘大鼠血液中及肺組織中的炎性因子及炎性細胞水平。 因此,在本研究中,我們利用OVA 誘導建立哮喘幼年大鼠模型,結果發現哮喘幼年大鼠呼吸急促,口唇發紺,明顯煩躁不安,鏡下可見肺組織結構損壞嚴重,炎性細胞大量浸潤,且炎癥評分升高,幼年大鼠在吸入不同濃度的Ach 激發后,其Penh 值顯著升高,BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGF-β1 含量顯著升高,BALF 上清液中白細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數顯著升高,表明哮喘可引起幼年大鼠肺組織炎癥反應,呼吸障礙,揭示模型建立成功。

黃芪是臨床重用的中藥材,黃芪皂苷Ⅱ是該藥活性成分,具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性。 研究發現,黃芪可以調節呼吸道、消化道以及胃粘膜分泌功能,增強人體第一道防線,黃芪活性成分黃芪多糖能顯著抑制IL-6、IL-1β、TNF-α 的分泌,治療炎癥反應[17-18]。 本研究采用黃芪皂苷Ⅱ對哮喘幼年大鼠進行藥效學分析,研究結果顯示,哮喘幼年大鼠經黃芪皂苷Ⅱ處理后,幼年大鼠肺組織結構較為正常,支氣管腔內炎性細胞浸潤明顯減少,黏膜水腫改善,無明顯脫落,肺組織炎癥評分降低。 Ach 激發后Penh 值顯著降低,BALF 上清液和血清中IL-6、IL-21 和TGF-β1 含量顯著降低,BALF上清液中白細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數顯著降低,表明黃芪皂苷Ⅱ能明顯抑制哮喘幼年大鼠的炎癥反應,降低幼年大鼠氣道反應性,減輕肺組織病理損傷,且隨著藥物劑量增大,效果更加顯著。

氣道炎癥是哮喘的典型特征,緩解炎癥反應可有效控制哮喘癥狀。 近年來發現,在多種與免疫有關的疾病中,IL-21 表達明顯上調[19-20]。 STAT3 蛋白是IL-21 的主要信號傳導因子,其磷酸化活化后可參與多種自身免疫性疾病產生和進展過程[10]。本研究結果說明在哮喘幼年大鼠體內,IL-21/STAT3通路被激活,可能與炎癥反應與免疫反應增強,肺組織受損有關。 吳愛祥[21]研究發現黃芪甲苷可通過抑制STAT3 通路,減輕炎性因子MCP-1 水平。

本研究中黃芪皂苷Ⅱ可下調哮喘幼年大鼠體內IL-21 蛋白表達及STAT3 磷酸化水平,表明黃芪皂苷Ⅱ可調節IL-21/STAT3 信號通路,因此我們推測黃芪皂苷Ⅱ減輕幼年大鼠哮喘癥狀,減少炎癥反應等功能可能與抑制IL-21/STAT3 通路活化有關。

綜上所述,黃芪皂苷Ⅱ可能通過抑制IL-21/STAT3 通路,減輕哮喘幼年大鼠哮喘癥狀及氣道炎癥,修復肺組織功能,為臨床治療哮喘提供了新思路,但具體機制仍需進一步研究。